邵焱焱 ，米熱尼沙·庫爾班 ，閆夢陽 ，閆雪琪 ，范慶祥 ，袁曉峰 ，曾獻存

（1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.新疆和田市策勒縣畜牧獸醫(yī)工作站，和田 848000）

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。有研究表明，LncRNA在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等不同層次上均可調(diào)控基因表達水平，而且在細胞分化、細胞周期調(diào)控、生長發(fā)育、基因組印記和配子生成等許多生命過程中發(fā)揮著極其重要的作用［1-3］。

策勒黑羊是我國特色新疆綿羊，主要集中在新疆和田地區(qū)，由于特殊的生態(tài)環(huán)境，具有耐粗飼、耐寒、抵抗力強、性成熟早、常年發(fā)情和繁殖率高等特點。策勒黑羊平均產(chǎn)羔率達215.46%，產(chǎn)后20～30 d便可發(fā)情，目前大部分牧區(qū)已實行一年兩產(chǎn)或兩年三產(chǎn)模式。因此，充分開發(fā)利用策勒黑羊優(yōu)良性能和多胎性，對新疆綿羊的長久發(fā)展具有重要意義［4-5］。LNC-010801和LNC-0085622個LncRNA是項目組前期通過策勒黑羊卵巢組織轉(zhuǎn)錄組測序的，本研究以策勒黑羊為實驗材料，檢測LNC-010801和LNC-008562在策勒黑羊發(fā)情周期不同階段卵巢組織中的表達水平，為后續(xù)研究LncRNA參與策勒黑羊繁殖性狀的調(diào)控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

參考產(chǎn)羔記錄，在大群體中選擇3～4歲策勒黑羊（多胎個體）15～20只。于早晚放入試情公羊，結(jié)合外陰檢查和陰道檢查，判斷羊只是否發(fā)情。母羊第一次有發(fā)情表現(xiàn)時到下次發(fā)情的間隔時間即為1個發(fā)情周期。在下次發(fā)情周期的發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、發(fā)情間期4個不同階段，分別屠宰策勒黑羊3只，采集卵巢組織，立即置于液氮中保存用于后續(xù)分析。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara-RR820A，熒光定量管，DD水，槍頭，熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 卵巢組織總RNA的提取 按TRIzol提取試劑盒操作說明，提取發(fā)情周期不同階段卵巢組織的總RNA，使用Nanodrop檢測RNA的純度，Agilent 2100及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。經(jīng)檢測符合測序質(zhì)量要求的各RNA樣品，用于后續(xù)研究。

1.3.2 實時熒光定量檢測 2個LncRNA引物見表1，引物由上海生工合成。

按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒說明書操作進行基因組DNA去除和反轉(zhuǎn)錄。去除基因組DNA反應：20 μL反應體系為5×gDNA Eraser Buffr 4 μL，gDNA Eraser 2 μL，Total RNA 1 μL，補水至 20 μL，在冰上配制反應混合液，在 42 ℃2 min。反轉(zhuǎn)錄反應：反應體系40 μL，上述反應液20 μL，PrimeScrt RT Enzyme Mix Ⅰ 2 μL，RT Primer Mix 2 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）8 μL，補水至 40 μL，37℃ 5 min，8℃ 5 s。

表1 LNC-010801、LNC-008562及內(nèi)參擴增引物

按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（Takara）說明書操作進行Real Time PCR反應：上、下游引物各1 μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，RT 反應液 2 μL。擴增程序采用兩步法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共45個循環(huán)。每個樣品重復3次。

1.3.3 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 采用2-△△ct法進行相對定量分析，用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)檢

對策勒黑羊卵巢組織提取的總RNA進行純度、總量和完整性檢測，結(jié)果表明，RNA質(zhì)量和完整性較好，未發(fā)生明顯降解，可以用于本實驗。電泳檢測結(jié)果見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 策勒黑羊卵巢組織LNC-010801、LNC-008562 LncRNA表達水平的結(jié)果分析

標準曲線結(jié)果顯示（如圖2、3），在同一時期相同基因的樣品中，擴增曲線平整，指數(shù)區(qū)較光滑，且重復性較好，熔解曲線平滑，峰值單一，說明LncRNA擴增有效準確。

圖2 LNC-010801擴增曲線和熔解曲線

圖3 LNC-008562擴增曲線和熔解曲線

2.3 策勒黑羊發(fā)情周期不同階段卵巢組織LNC-010801、LNC-008562 LncRNA 表達量

實時定量PCR檢測差異表達LncRNA結(jié)果表明（如表2），策勒黑羊不同發(fā)情周期階段LNC-010801、LNC-008562 LncRNA在卵巢組織中均有表達，呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢。LNC-010801的表達量在發(fā)情前期卵巢組織中顯著高于發(fā)情期（P＜0.05）和發(fā)情后期（P＜0.05）；LNC-008562的表達量在發(fā)情期卵巢組織中極顯著高于發(fā)情間期（P＜0.01）、顯著高于發(fā)情前期（P＜0.05）和發(fā)情后期（P＜0.05）。

表2 發(fā)情周期不同階段卵巢組織中LNC-010801、LNC-008562 LncRNA的表達量

3 討論

目前，LncRNA的研究在畜禽方面已有不少報道，但在動物繁殖領(lǐng)域卻很少被報道。研究表明，LncRNA的表達水平比mRNA低，且具有時空特異性和組織特異性。在不同組織或者不同發(fā)育階段差異表達LncRNA的篩選已經(jīng)在很多研究中被用于尋找功能性LncRNA［6-8］，LncRNA分子對哺乳動物生殖以及配子生成等方面具有重要調(diào)節(jié)作用。Caballero等［9］對牛卵母細胞以及胚胎發(fā)育早期階段發(fā)現(xiàn)的3個LncRNA的表達和亞細胞定位進行了研究。LncRNA可以促進動物妊娠的建立，在小鼠體內(nèi)，若去除在黃體組織中高表達的Neat1基因，可導致小鼠不能妊娠［10］。LncRNA還可以促進動物早期胚胎發(fā)育。研究者們通過研究發(fā)現(xiàn)，在不同胚胎發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)大量LncRNAs［11］。綿羊的繁殖性能主要受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，其中綿羊LncRNA在性腺軸（下丘腦-垂體-卵巢-子宮）中均有表達，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［1-2］。但綿羊LncRNA的研究尚處于起步階段，其功能及調(diào)控機制還需要深入研究。研究檢測發(fā)現(xiàn)，LNC-010801、LNC-008562在策勒黑羊發(fā)情周期各個階段卵巢組織中的表達量不同，呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。LNC-010801在發(fā)情前期表達量達到最大值，發(fā)情期達最低；而LNC-008562在發(fā)情期表達量達到最大值，在發(fā)情間期達最低。這2個LncRNA在不同階段的表達量不同，可能是因為這2個LncRNA在綿羊發(fā)情周期卵巢組織中起的作用不同。因此LNC-010801、LNC-008562 LncRNA是研究綿羊繁殖性狀的重要候選LncRNA，為后續(xù)研究LncRNA參與策勒黑羊繁殖性狀的調(diào)控作用奠定基礎。

4 結(jié)論

基于實驗研究，策勒黑羊卵巢組織中LNC-010801和LNC-008562在發(fā)情周期不同階段卵巢組織中表達量有所不同，推測這2個LncRNA在綿羊發(fā)情周期卵巢組織中起不同的作用。本研究不僅豐富了綿羊非編碼RNA數(shù)據(jù)，也為闡明綿羊多胎性能的分子調(diào)控機理提供分子生物學方面的理論依據(jù)。