周珺　　袁遠

[摘要] 目的 探討IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用。 方法 選取2016年9月～2017年9月來我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者（觀察組）和同期來我院體檢的30例健康者（對照組）為研究對象，觀察組患者給予地塞米松進行治療，采集治療前后血液樣本，比較分析血漿中Kyn、Trp、 Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+T 淋巴細胞中TTS、IDO的表達。 結果 治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療前，觀察組CD4+、CD8+T 淋巴細胞中IDO水平顯著高于對照組，TTS水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效組患者CD4+、CD8+T 淋巴細胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療無效組患者治療前后各項指標無顯著差異（P>0.05）。 結論 IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑與免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病相關，也可通過IDO/TTS評價患者的臨床療效，具有指導意義。

[關鍵詞] IDO；TTS；色氨酸；免疫性血小板減少癥

[中圖分類號] R558.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）17-0118-04

Exploration of the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia

ZHOU Jun YUAN Yuan

Clinical Laboratory， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway in the pathogenesis and treatment of immune thrombocytopenia. Methods 30 patients with immune thrombocytopenia（observation group） who came to our hospital from September 2016 to September 2017 and 30 healthy people（control group） who had physical examination in our hospital during the same period were selected as the study subjects. Patients in the observation group were treated with dexamethasone， and the blood samples before and after treatment were collected. The levels of Kyn， Trp， Kyn/Trp in the plasma， and the expressions of TTS and IDO in CD4+ and CD8+ T lymphocytes were analyzed and compared. Results Before treatment， the levels of Kyn， Trp and Kyn/Trp in the observation group were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， the Trp level was decreased in plasma in the effective group. The levels of Kyn and Kyn/Trp were increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）； before treatment， IDO levels in CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the observation group were significantly higher than those in the control group. The level of TTS was significantly lower than that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）； after treatment， IDO levels in the CD4+ and CD8+T lymphocytes in the effective group were increased， and the level of TTS was decreased. The differences were statistically significant（P<0.05）； there was no significant difference in each index before and after treatment in the ineffective treatment group（P>0.05）. Conclusion The IDO/TTS-mediated tryptophan metabolic pathway is associated with the onset of immune thrombocytopenia. IDO/TTS can also be used to evaluate the clinical efficacy of patients， with guiding significance.

[Key words] IDO； TTS； Tryptophan； Immune thrombocytopenia

原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）[1，2]，既往稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，屬于獲得性自身免疫性疾病之一[3]。目前認為ITP的發(fā)病機制是由于患者體內T淋巴細胞異?；罨珺淋巴細胞被激活[4，5]，患者對自身血小板抗原免疫失耐受，產生針對自身血小板抗原的免疫性抗體，通過體液免疫、細胞免疫，導致患者體內血小板的過度破壞和生成受抑，血小板減少，伴或不伴皮膚黏膜出血，是臨床常見的出血性疾病之一[6]。色氨酸（tryptophan，Trp）是細胞生長代謝過程中的必需氨基酸，參與多種組織器官的代謝，吲哚胺2，3-雙加氧酶（ndoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）是Trp沿犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）代謝的關鍵酶[7]，而當Trp濃度降低時，可抑制T淋巴細胞的增殖。目前，臨床上對于ITP主要給予地塞米松進行治療[8，9]，本研究通過觀察健康人和ITP患者，以及ITP患者治療前后血漿中Kyn、Trp、Kyn/Trp的水平，以及CD4+、CD8+ T淋巴細胞中TTS、IDO的表達，旨在探討IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月～2017年9月來我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者和同期來我院體檢的30例健康人為研究對象，其中免疫性血小板減少癥患者為觀察組，健康體檢者為對照組。其中，觀察組男13例，女17例；年齡12～67歲，平均（32.8±4.0）歲。對照組男14例，女16例；年齡11～68歲，平均（32.6±4.1）歲。納入標準：所有觀察組患者均符合《血液病診斷及療效標準》[11]中原發(fā)免疫性血小板減少癥的診斷標準，其中血小板為（0～59）×109/L，血小板平均計數為（16.8±2.0）×109/L。排除標準：①伴有其他自身免疫性疾病患者；②糖尿病、高血壓等慢性疾病患者；③肺結核、消化性潰瘍、肝炎等感染性疾??；④近1個月內無糖皮質激素或免疫抑制劑治療史。兩組患者在性別、年齡等一般資料上比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

觀察組患者給予40 mg/d地塞米松（廣西萬德藥業(yè)股份有限公司，國藥準字：H20113234，規(guī)格：5 mg/1 mL）+200 mL生理鹽水中靜滴，療程為4 d[12]，采集健康體檢者以及治療前和治療后5 d免疫性血小板減少癥患者的肝素血液樣本。

1.3 療效判定標準

根據患者的臨床療效結果，分為完全緩解、有效、無效三個等級，完全緩解：患者無出血，且血小板計數≥100×109/L；有效：患者無出血，且血小板計數≥30×109/L或增加2倍；無效：患者有出血或血小板計數<30×109/L。臨床有效率=（完全緩解例數+有效例數）/總病例數×100%[10]。

1.4 處理方法

1.4.1 液相-質譜聯用分析 通過液相-質譜聯用分析系統(tǒng)（LC-MS/MS）比較分析血漿中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的濃度以及Kyn/Trp的比值。具體方法為：將經抗凝處理后的100 μL血漿樣品加入200 μL乙腈中，渦旋混勻，靜置，以14000 r/min的速度離心30 min，取上清，加入色譜柱內進行分析。設置流速度為0.2 mL/min，其中，流動相A相為乙腈：水=5：95；流動相B相：乙腈：水=95：5（A、B相均含0.1%的甲酸）。

1.4.2 流式細胞儀分析 通過流式細胞儀比較分析CD4+、CD8+T淋巴細胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達。具體方法為：取10 mL的肝素抗凝血，分離外周單個核細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL，加入固定劑，渦旋混勻固定，每管中各加入5 μL抗體，4℃避光孵育30 min。加入500 μL的固定劑，室溫渦旋混勻固定后PBS洗滌。加入200 μL破膜劑，以1500 r/min的速度離心15 min，棄上清。每管加4 μL的IDO抗體，及5 μL的TTS抗體，室溫避光孵育。再次加破膜劑、PBS洗滌后重懸細胞，加5 μL二抗，4℃避光孵育，將處理好的樣品加入BD CantoⅡ流式細胞儀中檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞中TTS、IDO的表達，通過FACS Diva7.0軟件進行結果分析，以熒光強度來評價CD4+、CD8+T淋巴細胞中TTS、IDO的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件進行數據分析。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 觀察組患者臨床療效情況

經地塞米松治療后，免疫性血小板減少癥患者中15例完全緩解，8例有效，7例無效，患者的臨床有效率為76.67%。

2.2 治療前后血漿Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平情況比較

治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效觀察組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），無效觀察組患者血漿中Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平無顯著差異（P>0.05）。見表1。

2.3 治療前后CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO、TTS的表達水平情況

治療前，觀察組CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO水平顯著高于對照組，TTS水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效觀察組患者CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療無效觀察組患者治療前后CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO、TTS水平無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種淋巴細胞介導的出血性疾病[13，14]，其發(fā)病機制尚未完全明確，早期大多數學者傾向于是由于患者的體液免疫，患者體內產生過多的血小板抗體，導致血小板的過多破壞[15，16]，而近年來，學者們更傾向于是由于患者細胞免疫，其自身的CD4+T淋巴細胞是觸發(fā)患者體內血小板自身免疫應答的關鍵，而CD8+T淋巴細胞介導的細胞毒性，導致患者血小板的破壞增加，加重疾病。色氨酸（tryptophan，Try）是細胞生長代謝的必需氨基酸，犬尿氨酸途徑是Try最主要的代謝途徑，人體內約95%的Try經此途徑代謝，Try在吲哚胺-2，3-雙加氧酶（Indoleam-ine2，3-dioxygenase，IDO）的作用下生成甲酰犬尿氨酸，后者迅速在犬尿氨酸甲酰胺酶的作用下生成犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）。IDO是含亞鐵血紅素的單肽鏈[17]，是Trp代謝的關鍵酶和限速酶[18]，Trp是細胞維持正常生理功能必不可少的氨基酸之一，IDO介導的色氨酸代謝在調節(jié)T細胞介導的免疫應答和感染中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現，當Trp濃度降低時，細胞的增殖受到抑制，細胞處于靜止期，阻斷T淋巴細胞的免疫應答。TTS能夠催化Trp與其結合，增加細胞內Trp的儲備，調節(jié)Trp的代謝過程，調控免疫應答[19]。IDO和TTS通過參與Trp代謝過程而參與多種自身免疫性疾病的調控，Kyn/Trp值是IDO活性的評估標準。目前臨床上對于ITP缺乏特異性的治療方法，常用的治療方案包括糖皮質激素、免疫抑制劑、人免疫球蛋白、促血小板生成素等。地塞米松是目前臨床上公認的用于治療免疫性血小板減少癥的藥物，其療效顯著、起效時間短、副作用少等優(yōu)點[20，21]。ITP患者存在IDO和TTS表達的異常，地塞米松治療對IDO/TTS代謝途徑是否有影響，未見相關報道。

本研究中，選取2016年9月～2017年9月來我院就診的30例免疫性血小板減少癥患者和同期來我院體檢的30例健康者為研究對象，其中免疫性血小板減少癥患者為觀察組，健康體檢者為對照組，觀察組患者給予地塞米松進行治療，采集健康體檢者以及治療前和治療后5 d免疫性血小板減少癥患者的血液樣本，通過液相-質譜聯用分析系統(tǒng)（LC-MS/MS）比較分析血漿中犬尿氨酸（Kyn）、色氨酸（Trp）的濃度以及Kyn/Trp的比值，通過流式細胞儀比較分析CD4+、CD8+T淋巴細胞中色氨酰-tRNA合成酶（TTS）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達。結果顯示：治療前，觀察組Kyn、Trp以及Kyn/Trp水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效組患者血漿中Trp水平降低，Kyn、Kyn/Trp水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療前，觀察組CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO水平顯著高于對照組，TTS水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療后，有效組患者CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO水平水平升高，TTS水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；治療無效組患者治療前后血漿Kyn、Trp、Kyn/Trp水平，以及CD4+、CD8+T淋巴細胞中IDO、TTS水平無顯著差異（P>0.05）。

綜上所述，IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑與免疫性血小板減少癥患者的發(fā)病相關，也可通過IDO/TTS評價患者的臨床療效，具有指導意義。

[參考文獻]

[1] Zhang J，Liang Y，Ai Y，et al.Eltrombopag versus romiplostim in treatment of children with persistent or chronic immune thrombocytopenia：A systematic review incorporating an indirect-comparison meta-analysis[J].Sci Rep，2018，8（1）：576.

[2] Arai Y，Jo T，Matsui H，et al.Comparison of up-front treatments for newly diagnosed immune thrombocytopenia-a systematic review and network meta-analysis[J]. Haematologica，2018，103（1）：163-171.

[3] Cantoni S，Carpenedo M，Mazzucconi MG，et al.Alternate use of thrombopoietin receptor agonists in adult primary immune thrombocytopenia patients：A retrospective collaborative survey from Italian hematology centers[J].Am J Hematol，2018，93（1）：58-64.

[4] Gudbrandsdottir S，Brimnes M，Kollgaard T，et al.Effects of rituximab and dexamethasone on regulatory and proinflammatory B-cell subsets in patients with primary immune thrombocytopenia[J].Eur J Haematol，2018，100（1）：45-52.

[5] Jotatsu T，Oda K，Yamaguchi Y，et al.Immune-mediated thrombocytopenia and hypothyroidism in a lung cancer patient treated with nivolumab[J]. Immunotherapy，2018， 10（2）：85-91.

[6] Newland A，Lee EJ，McDonald V，et al. Fostamatinib for persistent/chronic adult immune thrombocytopenia[J].Immunotherapy，2018，10（1）：9-25.

[7] 劉鑫，楊青.色氨酸代謝限速酶IDO1及其抑制劑的研究[J].生命的化學，2016，36（6）：774-782.

[8] Mithoowani S，Gregory-Miller K，Goy J，et al. High-dose dexamethasone compared with prednisone for previously untreated primary immune thrombocytopenia： A systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Haematol，2016， 3（10）： e489-e496.

[9] Godeau B.High-dose dexamethasone or oral prednisone for immune thrombocytopenia？[J].Lancet Haematol，2016， 3（10）：e453-e454.

[10] 陳秋杰，曾玉，高云龍，等. IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑在免疫性血小板減少癥患者發(fā)病及治療中的作用[J].實用醫(yī)學雜志，2014，30（21）：3441-3444.

[11] 張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京：科學出版社，2007：172-175.

[12] Chapin J，Lee CS，Zhang H，et al. Gender and duration of disease differentiate responses to rituximab-dexamethasone therapy in adults with immune thrombocytopenia[J].Am J Hematol，2016，91（9）：907-11.

[13] Niscola P，Scaramucci L，Giovannini M. Spleen tyrosine kinase inhibition：A new promising approach to chronic and refractory immune thrombocytopenia[J]. Immunotherapy，2018，10（1）：5-7.

[14] Okubo Y，Michihata N，Morisaki N，et al.Recent trends in practice patterns and comparisons between immunoglobulin and corticosteroid in pediatric immune thrombocytopenia[J].Int J Hematol，2018，107（1）：75-82.

[15] Sim DW，Yu JE，Jeong J，et al.Ciprofloxacin-induced immune-mediated thrombocytopenia：No cross-reactivity with gemifloxacin[J]. J Clin Pharm Ther，2018，43（1）：134-136.

[16] Teichman J，Taher A，Hashi A，et al. A sticky situation：Myocardial infarction in a young woman with immune thrombocytopenia on eltrombopag and a history of mediastinal radiation[J]. J Thromb Thrombolysis，2018，45（1）：192-195.

[17] 賈云瀧，王郁，劉麗華.IDO與腫瘤免疫逃逸[J].中國腫瘤生物治療雜志，2014，21（6）： 693-697.

[18] 張勝男，劉鑫，楊青.吲哚胺2，3-雙加氧化酶1及其抑制劑的研究[J].復旦學報（醫(yī)學版），2017，44（1）：1-7.

[19] 周映紅.小分子IDO-1抑制劑研究進展[J].中國抗生素雜志，2016，41（10）：721-726.

[20] Feng Q，Xu M，Yu YY，et al. High-dose dexamethasone or all-trans-retinoic acid restores the balance of macrophages towards M2 in immune thrombocytopenia[J]. J Thromb Haemost，2017，15（9）：1845-1858.

[21] Liu Z，Wang M，Zhou S，et al.Pulsed high-dose dexamethasone modulates Th1-/Th2-chemokine imbalance in immune thrombocytopenia[J].J Transl Med，2016，14（1）：301.

（收稿日期：2018-01-31）