劉若鴻，劉春雨，張譽(yù)凡，孫紅玉，湯禮軍

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種以胰腺局部和全身炎癥反應(yīng)為特征的疾病[1]，其病情危重，病死率在30%以上[2]。伴發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是SAP患者死亡的重要原因[3]。因此，在病情早期對已經(jīng)激活的炎癥瀑布反應(yīng)進(jìn)行有效控制，恢復(fù)機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)是改善SAP患者預(yù)后的關(guān)鍵。SAP患者多伴有胰腺炎相關(guān)腹水(pancreatitis associated ascitic fluids，PAAF)，研究證實(shí)，PAAF內(nèi)含有多種毒性成分，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)等炎癥因子和脂肪酶、淀粉酶、游離脂肪酸、內(nèi)毒素等毒性物質(zhì)，對SAP病程中炎癥的發(fā)展有重要影響[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage，APD)排出患者腹腔的PAAF，可安全有效地改善SAP病情，降低后續(xù)侵入性治療和疾病重癥化的概率[7-9]。同時，動物模型證實(shí)，APD能改善腸屏障功能，防止腸道細(xì)菌移位[10-12]，減輕腎、肺等器官的損傷[13-14]。但APD在SAP早期炎癥反應(yīng)中的具體作用尚不明確。

巨噬細(xì)胞作為一種具有高度可塑性的細(xì)胞[15]，可根據(jù)所處微環(huán)境的不同在促炎的M1極化表型和抑炎的M2表型之間相互轉(zhuǎn)換[16-18]。研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在SAP的發(fā)生和演進(jìn)過程中扮演著重要角色，特別是腹腔巨噬細(xì)胞能與PAAF發(fā)生廣泛的相互作用，既能受腹腔環(huán)境的影響改變自身的極化表型，又可在腹腔內(nèi)持續(xù)釋放炎癥因子，改變腹腔內(nèi)的炎癥環(huán)境[19-20]。然而APD能否通過改變腹腔環(huán)境，增加M2型巨噬細(xì)胞比例，進(jìn)而發(fā)揮緩解SAP病情的作用尚不明確。

本研究觀察APD大鼠與SAP大鼠胰腺損傷情況、全身炎癥反應(yīng)程度以及腹腔巨噬細(xì)胞極化表型和細(xì)胞因子表達(dá)的差異，探討APD對腹腔巨噬細(xì)胞表型極化的影響，以期為采用APD策略治療SAP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SPF級SD大鼠36只，體重200～250g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗動物有限公司。動物麻醉機(jī)及動物用異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，牛磺膽酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司，ELIAS試劑盒購自貝塞維斯生物科技有限公司，RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國寶生物工程有限公司，qPCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。

1.2 動物分組及模型制備 36只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為SAP組、APD組和假手術(shù)對照組(Sham組)，每組12只，給予12h晝夜交替光照。大鼠術(shù)前12h禁食水，術(shù)后禁食，自由飲水。造模前予異氟烷吸入全身麻醉。SAP組和APD組采用文獻(xiàn)報道的方法[21]，用微量注射泵向胰膽管內(nèi)逆行注射5%?；悄懰徕c溶液，用量為0.1ml/100g體重。APD組造模成功后立即于右下腹開孔，置入引流管并外接負(fù)壓引流球后關(guān)腹[11]。Sham組大鼠不注射藥物，并在腹腔內(nèi)置入一段引流管后關(guān)腹。各組大鼠于術(shù)后在背部皮下按40μl/g用量注射37℃生理鹽水補(bǔ)液。大鼠均于造模后12h取材，采用腹腔灌洗法提取巨噬細(xì)胞，并采集血液和胰腺組織。腹腔巨噬細(xì)胞在提取后分為兩份，一份立即用于流式細(xì)胞儀分析，另一份提取RNA后用于qPCR檢測；血液標(biāo)本3000r/min離心15min后留取上清，–80℃儲存；胰腺組織置于4%多聚甲醛中固定24h后包埋切片。

1.3 胰腺病理組織學(xué)分析 沿胰膽管縱行切取固定后的胰腺組織，用石蠟包埋后制成4μm厚切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察，根據(jù)文獻(xiàn)報道的評分方法[22]，從水腫、壞死、出血、炎細(xì)胞浸潤4個維度，由2名病理醫(yī)師進(jìn)行病理損傷評分，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野評分后取平均值，結(jié)果取各項評分平均值的和。

1.4 ELISA檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量以驗證SAP模型是否建立成功，檢測血清促炎因子IL-1β、TNF-α和抑炎細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)濃度以分析APD對SAP大鼠全身炎癥水平的影響。ELIAS檢測的具體步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，采用全自動酶標(biāo)儀(Thermofisher，美國)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 細(xì)胞提取與流式細(xì)胞術(shù)分析 大鼠麻醉后，排盡腹水，再按文獻(xiàn)[23]報道的方法，向腹腔內(nèi)注射20ml預(yù)冷PBS，按摩腹腔20s后用20ml注射器抽取到抗凝管中靜置10min。以PBS洗滌后用Alexa-Fluor647-conjugated anti-CD68(Bio-Rad，美國)、PECY7-conjugated anti-TNF-α(Thermofisher，美國)、FITC-conjugated anti-CD163(Bio-Rad，美國)等熒光一抗進(jìn)行染色，分別作為巨噬細(xì)胞共同表面標(biāo)志和M1、M2型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志。以上操作均在冰上完成。使用FACS Calibur(BD Biosciences，美國)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并用FlowJo (FlowJo，美國)軟件分析檢測結(jié)果。

1.6 腹腔細(xì)胞RNA提取與qPCR檢測 使用AxyPrep總RNA制備試劑盒。按照說明書所述步驟從洗滌好的上述腹腔細(xì)胞中提取總RNA，使用微量核酸儀(NanoDrop Technologies，美國)檢測260nm及280nm處的吸收峰并測定濃度，取100ng RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并保存在–80℃。

應(yīng)用SYBR Green Master Mix擴(kuò)增上述cDNA并分析對應(yīng)mRNA表達(dá)，以GAPDH RNA為內(nèi)參，GAPDH引物為商品化的大鼠內(nèi)參基因NAPDH引物(BBI Life Science，中國)。所有樣品均設(shè)3個復(fù)孔。TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、CD206、CD163的引物序列見表1。

表1 大鼠目標(biāo)基因及內(nèi)參引物序列Tab.1 Target genes and internal reference primers of rats

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APD對胰腺組織病理損傷及胰腺炎血清指標(biāo)的影響 HE染色結(jié)果顯示，建模后12h，SAP組大鼠胰腺組織明顯水腫，腺泡細(xì)胞廣泛空泡化、壞死，腺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，胰腺間質(zhì)內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤及嚴(yán)重出血，呈嚴(yán)重的組織損傷狀態(tài)，而APD組大鼠胰腺組織表現(xiàn)為局限性水腫，空泡化和壞死的腺泡細(xì)胞明顯減少，腺泡組織基本完整，胰腺間質(zhì)內(nèi)可見少量紅細(xì)胞滲出和炎細(xì)胞浸潤，炎癥和組織損傷明顯減輕(圖1A)。APD組大鼠胰腺組織病理評分為(5.90±0.99)分，明顯低于SAP組的(9.70±1.22)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1B)。

ELISA檢測結(jié)果顯示，造模成功后，SAP組和APD組的血清淀粉酶濃度分別為(1.302±0.052)ng/ml和(0.906±0.102)ng/ml，脂肪酶濃度分別為(12.251±0.458)U/L和(10.118±1.019)U/L，均高于Sham組的(0.346±0.041)ng/ml和(5.985±0.734)U/L，且SAP組的血清淀粉酶、脂肪酶濃度明顯高于APD組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1C、D)。

2.2 APD對SAP大鼠全身炎癥水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與SAP組比較，APD組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-1β濃度明顯降低，而抗炎因子IL-10、TGF-β濃度明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.3 APD對腹腔巨噬細(xì)胞極化表型的影響 選擇CD68作為巨噬細(xì)胞標(biāo)志，TNF-α作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，CD163作為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對各組大鼠腹腔灌洗液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，APD組大鼠腹腔灌洗液中CD163陽性細(xì)胞所占比例為26.06%，明顯高于SAP組(7.05%)，而APD組大鼠腹腔灌洗液中TNF-α陽性細(xì)胞所占比例為5.46%，明顯低于SAP組(69.4%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即APD組大鼠腹腔灌洗液中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖3)。

2.4 APD對腹腔細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響qPCR檢測結(jié)果顯示，APD組腹腔細(xì)胞中M2相關(guān)蛋白CD163、CD206的基因表達(dá)水平明顯高于SAP組(P＜0.05)，而M1相關(guān)蛋白TNF-α、iNOS的基因表達(dá)水平各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

3 討 論

由于含有大量毒性物質(zhì)，PAAF一直以來都被認(rèn)為在急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。大量研究指出，PAAF中含有的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物能通過干預(yù)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，加劇胰腺炎病情[4]，PAAF中的血紅蛋白能上調(diào)HIF/VEGF信號通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和肺損傷[24-25]，更為重要的是，有研究證實(shí)，PAAF能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎因子，并抑制抑炎信號通路的激活[5]。本課題組在充分體液復(fù)蘇和營養(yǎng)支持治療的基礎(chǔ)上，建立了早期APD治療重癥急性胰腺炎的策略，在臨床和動物模型中證實(shí)APD能通過排出PAAF緩解胰腺炎病情[4-11]。此外，還發(fā)現(xiàn)APD能抑制SAP過程中的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡[13]，并通過降低腸道XDH/XOD的動員，減輕胰腺炎相關(guān)性肺損傷[14]，通過減少腸道細(xì)菌移位，改善腸屏障功能，緩解胰腺炎腸道損傷[11]。然而，APD對SAP早期炎癥反應(yīng)的作用尚未得到闡明。

圖1 APD對胰腺組織病理損傷及胰腺炎血清指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of APD on histopathological injury of pancreas and the level of pancreatitis biomarker in serum

圖2 APD對SAP大鼠血清抗炎和促炎細(xì)胞因子濃度的影響Fig.2 Effect of APD on the serous contents of anti- and pro- inflammatory cytokines

本研究發(fā)現(xiàn)，APD能通過抑制促炎因子及誘導(dǎo)抑炎因子的表達(dá)，改善SAP病情。眾所周知，IL-10和TGF-β是重要的抑炎因子，其表達(dá)上調(diào)在炎癥消退過程中發(fā)揮了重要作用[26-27]。本研究還發(fā)現(xiàn)，APD組大鼠血清IL-10和TGF-β濃度明顯高于SAP組，且反映SAP嚴(yán)重程度的血清指標(biāo)血淀粉酶、脂肪酶濃度以及胰腺組織病理損傷評分均明顯降低。

為了探討APD大鼠血清炎癥因子表達(dá)譜改變的機(jī)制，本研究檢測了各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞表型的差異。腹腔巨噬細(xì)胞是腹腔內(nèi)主要的固有免疫細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞通過識別、吞噬、加工抗原，并將加工后的抗原遞呈給獲得性免疫細(xì)胞而引發(fā)炎癥，同時分泌大量促炎因子，而M2型巨噬細(xì)胞能通過多種機(jī)制減低抗原呈遞，并抑制獲得性免疫細(xì)胞的激活，分泌抑炎因子而發(fā)揮抑炎作用。此外，有研究證實(shí)，M1和M2型巨噬細(xì)胞能在一定條件下相互轉(zhuǎn)化[17-18,28]。本研究分別以TNF-α和CD163作為M1型和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，并以CD68作為巨噬細(xì)胞的共同標(biāo)志[29]，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了兩種不同表型腹腔巨噬細(xì)胞所占的比例，結(jié)果顯示，APD組大鼠腹腔CD163陽性巨噬細(xì)胞比例明顯高于SAP組，這一結(jié)果在qPCR實(shí)驗中也被證實(shí)，APD組大鼠腹腔細(xì)胞中M2相關(guān)蛋白CD163、CD206的基因表達(dá)水平明顯高于SAP組，表明APD能增加腹腔巨噬細(xì)胞中M2型所占的比例。

圖3 APD對腹腔巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響Fig.3 Influence of APD on the polarization of peritoneal macrophages

圖4 APD對腹腔細(xì)胞M1、M2相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of APD on the mRNA expression of M1 and M2 associated proteins

此外，本研究發(fā)現(xiàn)盡管APD組大鼠腹腔中M1型巨噬細(xì)胞少于SAP組，但其M1相關(guān)蛋白TNF-α、iNOS的基因表達(dá)水平與SAP組比較無明顯差異。由于巨噬細(xì)胞并不是只存在M1和M2兩種表型，而是在這兩種表型之間維持動態(tài)的平衡。同時，二者細(xì)胞因子的表達(dá)也是連續(xù)轉(zhuǎn)變和相互疊加的[30]。因此，筆者推測部分介于M1和M2兩種極化狀態(tài)之間的巨噬細(xì)胞仍在分泌促炎因子，腹腔穿刺操作給APD大鼠造成的額外損傷可能也是其炎癥因子分泌增加的原因之一。但是就增長的幅度來看，M2相關(guān)蛋白增長的幅度遠(yuǎn)大于M1相關(guān)蛋白，因此仍可認(rèn)為APD能使SAP大鼠腹腔細(xì)胞的炎癥狀態(tài)向抗炎的M2方向傾斜。

雖然本研究未對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制進(jìn)行深入分析，但一項近期研究顯示，在早期引流排出PAAF后，胰腺炎大鼠腹水中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子水平降低，抗炎因子IL-10水平明顯升高[31]。IL-10是巨噬細(xì)胞表型調(diào)控中的重要細(xì)胞因子，Shouval等[26]研究證實(shí)，在促M(fèi)1和促M(fèi)2兩種環(huán)境中敲除IL-10受體基因均能促進(jìn)促炎因子的表達(dá)。更為重要的是，在去除M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中的IL-10后，M2型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志物明顯降低，表明IL-10在M2型巨噬細(xì)胞表型的誘導(dǎo)和維持中是必需的。上述研究表明，通過排出腹腔促炎因子，增加IL-10等抑炎因子的濃度，能營造有利于巨噬細(xì)胞向M2方向極化的腹腔炎癥環(huán)境。此外，腹腔M2型巨噬細(xì)胞能否遷移到損傷的胰腺并發(fā)揮作用，以及腹腔M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能否進(jìn)入循環(huán)發(fā)揮抗炎作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，APD通過排出SAP腹腔內(nèi)的PAAF，增加腹腔M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，使其細(xì)胞因子表達(dá)向抗炎因子方向傾斜，從而發(fā)揮降低系統(tǒng)性炎癥水平，減輕胰腺病理損傷，緩解SAP病情的作用。