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脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞提取、制備及儲(chǔ)存質(zhì)量管理專(zhuān)家共識(shí)

2018-12-03 08:26:06中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會(huì)
解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2018年10期
關(guān)鍵詞:供者脂肪組織制劑

中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會(huì)

脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells,ASCs)是從脂肪組織中分離提取得到的,具有取材容易、對(duì)機(jī)體損傷小、體內(nèi)儲(chǔ)備量大、體外可大規(guī)模培養(yǎng)、可多向分化等優(yōu)點(diǎn)。ASCs在人體修復(fù)重建、免疫調(diào)節(jié)及組織再生等方面的應(yīng)用成為近年來(lái)干細(xì)胞研究的重要內(nèi)容,也是組織工程及再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[1-2]。

大量研究表明,自體脂肪組織移植到軟組織缺損部位后,其中40%~60%會(huì)被吸收,自體脂肪組織結(jié)合ASCs移植,能明顯減少自體脂肪組織移植的吸收、液化、壞死及纖維化等情況發(fā)生,有利于構(gòu)建具有生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的脂肪組織。同時(shí),利用脂肪組織可以進(jìn)行大規(guī)模的ASCs提取、制備、儲(chǔ)存,為再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞[3-5]。

目前,國(guó)內(nèi)外尚缺乏ASCs提取、分離、制備及儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理規(guī)范,導(dǎo)致各制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)之間無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)一評(píng)估和交流,嚴(yán)重制約了ASCs在皮膚軟組織修復(fù)重建等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。為了建立安全、規(guī)范、穩(wěn)定、可追溯的行業(yè)共識(shí)、指南及標(biāo)準(zhǔn),從源頭保證ASCs的提取、制備、儲(chǔ)存的高質(zhì)性和安全性,中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會(huì)聯(lián)合從事細(xì)胞制備和存儲(chǔ)、皮膚軟組織修復(fù)重建、分子生物學(xué)及整形和美容外科等多學(xué)科的專(zhuān)家,參照中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)《細(xì)胞庫(kù)質(zhì)量管理規(guī)范》及《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》,組織起草脂肪組織采集及ASCs制備、檢測(cè)、儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理專(zhuān)家共識(shí),旨在促進(jìn)ASCs在皮膚軟組織修復(fù)重建技術(shù)等領(lǐng)域研究成果的轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步促進(jìn)多學(xué)科的交流和發(fā)展[6-9]。

1 脂肪組織采集

1.1 脂肪組織采集機(jī)構(gòu)要求 脂肪組織的采集工作應(yīng)在取得《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中實(shí)施。采集人員應(yīng)持醫(yī)師或者護(hù)士執(zhí)業(yè)證書(shū),經(jīng)過(guò)相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)培訓(xùn)。采集機(jī)構(gòu)應(yīng)具有完整的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(standard operation procedure,SOP),并備有采集過(guò)程中的應(yīng)急預(yù)案。采集過(guò)程應(yīng)在層流手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作,最大限度地減少污染和交叉感染的發(fā)生。

1.2 脂肪組織供者要求 對(duì)供者健康狀況進(jìn)行全面檢查(如一般信息、既往病史和家族性遺傳病等)及病原微生物的感染篩查和在危險(xiǎn)疫區(qū)停留情況的調(diào)查。身體狀態(tài)良好、有完整體檢報(bào)告、無(wú)遺傳性家族病史、無(wú)惡性腫瘤、無(wú)急慢性傳染病及血液系統(tǒng)疾??;血常規(guī)及分類(lèi)、肝腎功能正常;人源性特定病毒(包括但不僅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)陰性、梅毒螺旋體陰性(提供脂肪組織的同時(shí),另需提供不少于8ml外周血用于復(fù)檢,ABO血型、HLA-Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)分型檢查,以備追溯性查詢(xún))。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV檢查結(jié)果為陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有處理感染性樣本的獨(dú)立物理空間、獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng),能做到使用后的器具和相關(guān)物品可經(jīng)過(guò)滅活處理后再移出該區(qū)域。感染性樣本與非感染性樣本的處理及制備不使用同一設(shè)備,方可進(jìn)行脂肪組織的采集,但必須使供者知情,同時(shí)通知接收、制備、質(zhì)控及醫(yī)護(hù)人員等做好防護(hù)措施。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備上述相對(duì)應(yīng)病原體陽(yáng)性制備/培養(yǎng)區(qū)時(shí),不得采集上述陽(yáng)性供者的脂肪組織。若供者HIV、梅毒螺旋體檢查結(jié)果為陽(yáng)性時(shí),不得采集供者的脂肪組織。高度懷疑HIV感染或者考慮HIV感染窗口期的供者不予采集[1,3,6-8]。

1.3 采集方式、采集部位和采集量

1.3.1 采集方式 用腫脹液(生理鹽水250ml+2%利多卡因10~15ml+腎上腺素0.25mg)局部浸潤(rùn)麻醉供脂肪組織區(qū)域,以20ml注射器配備口徑1.5~3.5mm、側(cè)孔3.0~5.0mm的吸脂針,進(jìn)入供區(qū),形成負(fù)壓,呈扇形手動(dòng)均勻吸取脂肪組織,吸出3~5mm3脂肪組織顆粒,若脂肪組織顆粒較大,則需要進(jìn)行手工剪制。

1.3.2 采集部位 選擇下腹部或者大腿內(nèi)、外側(cè)或者身體其他部位(供者要求的吸脂部位)。接受注射溶脂、冷凍溶脂、熱立塑及超聲溶脂的部位不建議作為脂肪組織采集部位。供區(qū)針眼或切口處按壓排除腫脹液,進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訅喊?4~48h后更換包扎敷料,預(yù)防感染,7d針眼或切口愈合。

1.3.3 采集量(脂肪組織,腫脹液除外) 女性≤45歲,男性≤50歲,脂肪組織采集量不少于50ml。女性45~55歲、男性50~60歲者不少于80ml。男性體脂>25%、腰圍>100cm,女性體脂>33%、腰圍>88cm,不少于100ml。體脂率=[1.2×BMI+0.23×年齡-5.4-10.8×性別系數(shù)(男=1,女=0)]。女性>55歲,男性>60歲,或者近期服用減肥藥者不建議采集脂肪組織提取ASCs[10-11]。

1.4 脂肪組織運(yùn)輸和接收 吸取的脂肪組織應(yīng)保存于標(biāo)準(zhǔn)配置的無(wú)菌容器內(nèi),貼條碼標(biāo)簽,應(yīng)遵從安全與準(zhǔn)確的原則,做到樣本與供者一一對(duì)應(yīng),記錄啟運(yùn)時(shí)間和到達(dá)時(shí)間,低溫冷鏈運(yùn)輸,建議時(shí)間控制在48h內(nèi),送達(dá)制備機(jī)構(gòu)。制備機(jī)構(gòu)應(yīng)設(shè)置脂肪組織的接收取樣工作區(qū),執(zhí)行登記、初檢、核對(duì)、暫存、交接等;目檢脂肪組織有無(wú)污染或變質(zhì),應(yīng)建立脂肪組織異常情況處置標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[1]。

2 ASCs的制備與儲(chǔ)存

制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)應(yīng)建立相應(yīng)完善的SOP,所有試劑和原材料應(yīng)明確其來(lái)源、批號(hào)、質(zhì)量檢定合格報(bào)告,應(yīng)盡可能采用GMP臨床應(yīng)用級(jí)別的原料或國(guó)家已批準(zhǔn)的可臨床應(yīng)用的產(chǎn)品,相關(guān)制備、生產(chǎn)記錄及留樣應(yīng)至少保存至使用結(jié)束后3個(gè)月。制備人員應(yīng)該經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的技術(shù)培訓(xùn),ASCs的制備建議在B級(jí)背景下A級(jí)潔凈度級(jí)別的環(huán)境中進(jìn)行。

2.1 脂肪干細(xì)胞的分離 采集的脂肪組織用無(wú)菌生理鹽水沖洗,按照脂肪組織體積加入相應(yīng)濃度Ⅰ型膠原酶(建議GMP級(jí))或胰蛋白酶混合液,37℃水浴或氣浴振蕩,離心,吸棄上層脂肪和液體層,加入生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀,用細(xì)胞濾器過(guò)濾,去除未消化完全的組織團(tuán)塊,濾液離心,棄上清,獲得基質(zhì)血管成分(stromal vascular fraction,SVF)。SVF是圍繞在脂肪細(xì)胞周?chē)袃?nèi)皮細(xì)胞、非特征性基質(zhì)細(xì)胞、血液細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、脂肪來(lái)源的基質(zhì)/干細(xì)胞等細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞群,臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。填寫(xiě)細(xì)胞操作記錄,包括組織酶解分離時(shí)間、細(xì)胞數(shù)量和活性等[4,12-13]。

2.2 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 接種SVF至培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng),保持濕度。細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時(shí)可以傳代,收集消化的細(xì)胞懸液,接種至培養(yǎng)瓶中,傳代培養(yǎng),培養(yǎng)基應(yīng)使用無(wú)血清培養(yǎng)基或不含血清添加物的細(xì)胞培養(yǎng)基。填寫(xiě)細(xì)胞操作記錄,包括時(shí)間、批次、細(xì)胞數(shù)量等[12-14]。

2.3 建立脂肪干細(xì)胞種子細(xì)胞庫(kù) 收集P2或P3代細(xì)胞,做質(zhì)量檢測(cè)和性能指標(biāo)檢測(cè)(包括細(xì)菌、支原體、內(nèi)外源病毒、細(xì)胞活力、細(xì)胞鑒別、生長(zhǎng)特性、細(xì)胞純度、均一性及內(nèi)毒素等),調(diào)整細(xì)胞濃度至(2~3)×106個(gè)/ml,分裝至細(xì)胞凍存管中,貼標(biāo)簽,標(biāo)注細(xì)胞數(shù)量、凍存日期及代次等。將凍存管程序降溫后,轉(zhuǎn)入–196℃液氮保存,即為種子細(xì)胞庫(kù),供建立工作細(xì)胞庫(kù)用。填寫(xiě)細(xì)胞操作記錄,包括時(shí)間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等[1,3,6-9]。

2.4 建立脂肪干細(xì)胞工作細(xì)胞庫(kù) 經(jīng)脂肪干細(xì)胞種子細(xì)胞庫(kù)傳代增殖,將傳至P5代的細(xì)胞制成均質(zhì)細(xì)胞懸液,取樣進(jìn)行臨床使用前的質(zhì)量控制和安全鑒定(表1、2)。分裝于一定數(shù)量的凍存管,貼好對(duì)應(yīng)批次細(xì)胞標(biāo)簽,保存于–196℃液氮中,即為工作細(xì)胞庫(kù)。填寫(xiě)細(xì)胞操作記錄,包括時(shí)間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等。工作細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量控制和安全鑒定>種子細(xì)胞庫(kù)質(zhì)量控制和安全鑒定。

表1 ASCs基本性能指標(biāo)Tab.1 Basic performance index of ASCs

表2 ASCs安全性能指標(biāo)Tab.2 Safety performance index of ASCs

2.5 脂肪干細(xì)胞凍存數(shù)量 脂肪干細(xì)胞凍存的數(shù)量是根據(jù)實(shí)際需求來(lái)計(jì)算的,應(yīng)考慮后續(xù)檢定需要、保藏年限、檢測(cè)用數(shù)量及復(fù)檢頻率等,根據(jù)個(gè)體的需要確定,遵循“夠用原則”。ASCs細(xì)胞制劑建議設(shè)1×107個(gè)ASCs為1個(gè)單位。填寫(xiě)細(xì)胞操作記錄,包括時(shí)間、批次、細(xì)胞數(shù)量、凍存數(shù)量等。

3 ASCs的運(yùn)輸

3.1 參照中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》,ASCs制劑采取冷鏈運(yùn)輸,建議運(yùn)輸時(shí)間控制在48h內(nèi)。

3.2 應(yīng)建立ASCs制劑運(yùn)輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,運(yùn)輸方式等應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。防止發(fā)生損害、變質(zhì)、污染或其他不良影響。每批次ASCs制劑的整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程應(yīng)有發(fā)運(yùn)記錄,并能夠追蹤。

3.3 若存在安全隱患,應(yīng)立即召回ASCs制劑,由制備機(jī)構(gòu)進(jìn)行合法和符合倫理要求的處置并記錄存檔。

3.4 制備機(jī)構(gòu)如委托第三方機(jī)構(gòu)運(yùn)輸ASCs制劑,應(yīng)評(píng)估其承運(yùn)機(jī)構(gòu)的資質(zhì)。承運(yùn)人應(yīng)接受制備機(jī)構(gòu)相應(yīng)的培訓(xùn),確保其可按照脂肪干細(xì)胞制劑運(yùn)輸要求完成運(yùn)輸過(guò)程。應(yīng)由設(shè)有資質(zhì)的第三方機(jī)構(gòu)復(fù)核ASCs制劑運(yùn)輸[1,3,6-9]。

4 ASCs的質(zhì)量安全性

制備機(jī)構(gòu)根據(jù)ASCs自身特性、臨床研究情況,配備相關(guān)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和設(shè)備,確立制劑質(zhì)量檢驗(yàn)操作規(guī)程,所有檢測(cè)方法應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,可以委托有資質(zhì)的第三方開(kāi)展相關(guān)質(zhì)量檢測(cè)。檢驗(yàn)應(yīng)滿(mǎn)足安全性、質(zhì)量可控性和(或)有效性的基本要求,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)有質(zhì)量負(fù)責(zé)人或質(zhì)量受權(quán)人簽字審核[1,3,6-9]。

4.1 基本性能 ASCs的基本性能指標(biāo)包括細(xì)胞形態(tài)、周期倍增時(shí)間、細(xì)胞活性、增殖、細(xì)胞表型、集落形成、端粒酶活性等。

4.2 安全性能 ASCs的安全性能指標(biāo)包括微生物、內(nèi)毒素、核型、致瘤性、毒性、殘留物及人畜共患豬細(xì)小病毒檢測(cè),必要時(shí)包括病毒核酸檢測(cè),確保ASCs制劑臨床應(yīng)用的安全性。

5 ASCs的分化功能測(cè)定

5.1 向成骨細(xì)胞分化能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的ASCs,加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng),第19天行茜素紅染色,鏡下觀察。脂肪干細(xì)胞被茜素紅染成紅色,染色面積占總面積的比例≥50%。

5.2 向成軟骨細(xì)胞分化能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的ASCs,加入成軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng),第14天行甲苯胺藍(lán)或Ⅱ型膠原蛋白抗體進(jìn)行染色分析,染色面積占總面積比例≥80%。

5.3 向成脂肪細(xì)胞分化能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的ASCs,加入成脂肪分化條件培養(yǎng)基,第12天行油紅O染色,脂肪干細(xì)胞被油紅O染成紅色,染色面積占總面積的比例≥50%[11,15-18]。

6 ASCs的組織再生功能檢測(cè)

6.1 促血管形成功能 用含100ml/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)體系將ASCs以1×105個(gè)/ml密度與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),4h后,鏡下統(tǒng)計(jì)形成的血管環(huán)數(shù)≥37/10 000個(gè)細(xì)胞[10,19]。

6.2 巨噬細(xì)胞極化 用含100ml/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)體系將ASCs以1×105個(gè)/ml密度與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),24h后,與巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比,用ELISA試劑盒檢測(cè)上清中TNF-α、IL-1β、TGF-β及IL-10的表達(dá)水平,其中TNF-α、IL-1β水平應(yīng)下降,TGF-β、IL-10水平應(yīng)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[11,15]。

6.3 抗凋亡功能 ASCs培養(yǎng)24h后,取上清液,培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,與普通培養(yǎng)基成纖維細(xì)胞對(duì)照組相比,ASCs上清液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞組,成纖維細(xì)胞凋亡比例下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[16-18]。此三項(xiàng)內(nèi)容建議為ASCs質(zhì)量的參考指標(biāo),應(yīng)為制備機(jī)構(gòu)或研究應(yīng)用機(jī)構(gòu)ASCs研究?jī)?nèi)容。

7 追溯

7.1 應(yīng)建立完整的ASCs制備記錄系統(tǒng)、標(biāo)識(shí)標(biāo)簽系統(tǒng)、ASCs細(xì)胞制劑編碼系統(tǒng),以便于辨識(shí)并防止制劑混雜。

7.2 ASCs制備記錄包括每天的細(xì)胞狀況、細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)條件等具體信息。標(biāo)識(shí)系統(tǒng)應(yīng)記錄供者信息、脂肪組織收獲日期及ASCs制備時(shí)間、細(xì)胞數(shù)量/體積、儲(chǔ)存條件等。

7.3 每份ASCs細(xì)胞制劑應(yīng)編制唯一的編碼。編碼應(yīng)能追溯到供者信息以及該細(xì)胞制劑操作和最終處理的所有記錄。

7.4 轉(zhuǎn)移和運(yùn)輸記錄應(yīng)能追溯ASCs由采集機(jī)構(gòu)到制備儲(chǔ)存機(jī)構(gòu)的所有流轉(zhuǎn)過(guò)程[1,3,6-9]。

參與制訂專(zhuān)家共識(shí)人員:

湯蘇陽(yáng):中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)皮膚軟組織修復(fù)重建技術(shù)分會(huì)主任委員,原武警總醫(yī)院皮膚再生醫(yī)學(xué)科主任

史 央:江蘇得康生物科技有限公司技術(shù)總監(jiān)

鄭 巖:成都華美紫馨醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院主任

于卉影:原沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任

邵小燕:上海賽傲生物技術(shù)有限公司技術(shù)總監(jiān),中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)皮膚軟組織修復(fù)與重建技術(shù)分會(huì)細(xì)胞制備與存儲(chǔ)學(xué)組組長(zhǎng)

陳惠華:北京恒峰銘成生物科技有限公司技術(shù)總監(jiān)

共識(shí)評(píng)審專(zhuān)家:

夏照帆:中國(guó)工程院院士,海軍軍醫(yī)大學(xué)全軍燒傷研究所所長(zhǎng)

艾玉峰:美萊集團(tuán)總醫(yī)院院長(zhǎng),中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)美容與整形醫(yī)師分會(huì)副會(huì)長(zhǎng),中國(guó)整形美容協(xié)會(huì)美容與再生醫(yī)學(xué)分會(huì)副會(huì)長(zhǎng),中國(guó)整形美容協(xié)會(huì)民營(yíng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分會(huì)副會(huì)長(zhǎng),PAAFRRS中國(guó)整形分會(huì)副主席

楊 力:四川華美紫馨醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院院長(zhǎng),中華醫(yī)學(xué)會(huì)整形外科分會(huì)腫瘤整形外科學(xué)組副組長(zhǎng),中華醫(yī)學(xué)會(huì)整形外科分會(huì)血管瘤與脈管畸形學(xué)組副組長(zhǎng)

郜恒駿:中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)分會(huì)主任委員,上海分子醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心主任,上海生物芯片國(guó)家工程研究中心副主任

蔡志剛:北京大學(xué)口腔醫(yī)院副院長(zhǎng),中華醫(yī)學(xué)會(huì)組織再生專(zhuān)業(yè)委員會(huì)常委

馬 潔:北京醫(yī)院生物治療中心主任

魏英杰:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授(PI)

王建華:首都兒科研究所生物技術(shù)研究室教授(PI)

張傳宇:中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)細(xì)胞研究與治療專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員

郝好杰:中國(guó)香港生命工程研究院首席教授

侯明曉:原沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院院長(zhǎng),全軍醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重癥醫(yī)學(xué)委員會(huì)副主任委員

胡敏捷:蘇州般若生物科技有限公司總經(jīng)理

姜篤銀:山東大學(xué)第二附屬醫(yī)院燒傷整形科主任

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