，

(忻州師范學(xué)院生物系， 山西 忻州 034000)

蕓豆又稱菜豆，屬于豆科菜豆屬[1]。根據(jù)國際糧農(nóng)組織統(tǒng)計，種植蕓豆的國家和地區(qū)有90多個，是栽種面積僅次于大豆的小宗雜糧作物之一[2]。蕓豆在中國栽培的歷史久遠(yuǎn)[3]，在黑龍江、甘肅、山西等省均有種植[3]，其中山西省忻州市五寨縣有“紅蕓豆之鄉(xiāng)”之稱。蕓豆?fàn)I養(yǎng)豐富，其蛋白含量可達30.8%[4]，受到廣大消費者的喜愛。

種子萌發(fā)過程復(fù)雜。萌發(fā)前的種子具有較低的水勢[5]，利于水分的進入。種子吸水后，將會激活其大量的酶類，種子中儲存的營養(yǎng)物質(zhì)會發(fā)生變化，由大分子分解成了小分子，如種子儲藏蛋白被分解成游離的氨基酸，用于細(xì)胞的供能或是新蛋白的合成。而在種子萌發(fā)的這一過程中，水溶性蛋白與游離氨基酸的含量有先上升后下降的變化趨勢[27]，但關(guān)于它們之間的具體關(guān)系目前研究較少。

研究表明，大豆在發(fā)芽后的蛋白含量大于未發(fā)芽時，在發(fā)芽期間蛋白含量先下降后緩慢增加[7]；蕓豆種子的蛋白質(zhì)及游離氨基酸含量變化呈先升后降趨勢，當(dāng)芽長為2.01～2.50 cm時，蛋白質(zhì)含量增加了20.62%[2]；蕓豆種子在萌發(fā)時，可溶性蛋白含量變化為先增后減，游離氨基酸呈上升趨勢[6]。

對于蕓豆種子，研究大多集中于對其蛋白的性質(zhì)[8]和蛋白的提取與優(yōu)化[9]等方面，對其吸水規(guī)律及萌發(fā)期間的特性研究少見報道。本研究以4種不同品種的蕓豆為試驗材料，通過對發(fā)芽率等萌發(fā)指標(biāo)和水溶性蛋白含量等生理生化指標(biāo)的測定，探討蕓豆種子吸水規(guī)律及萌發(fā)特性，以期提高蕓豆種子的發(fā)芽率，為蕓豆的規(guī)范化生產(chǎn)、研究與開發(fā)具有生理活性的雜糧提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗4種蕓豆均為山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所陳喜民副研究員課題提供，蕓豆品種的編號及其物理性狀見表1。

表1 蕓豆品種及物理性質(zhì)

編號品種籽粒顏色百粒重(g)粒徑(mm)長寬105-04黑色19.309.835.94292-94白色20.419.506.203187-88花色52.1314.598.084191-92紅色55.1417.427.83

1.2 主要儀器與試劑

FA 2004 N電子天平(上海箐海儀器有限公司)；LC-4016型低速離心機 (安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；N-752型紫外可見分光光分度計(上海儀電分析儀器有限公司)；SPX-150 B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。主要試劑:考馬斯亮藍(lán)G 250、茚三酮、無水乙醇等均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子處理

4個品種分別挑選籽粒飽滿、大小一致且無損壞的蕓豆種子各10粒，并稱重。用75%乙醇滅菌1 min[10]，再用蒸餾水洗滌，超聲處理25 min[11]，40 kHz。將處理后的蕓豆種子放入已滅菌的培養(yǎng)皿中，于17，22，27 ℃等3個不同溫度下進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間保持培養(yǎng)皿中紗布的濕潤，保證蕓豆種子所需水分充足。

1.3.2 吸水規(guī)律的測定

分別于培養(yǎng)后的1，2，3，5，8，10，12 h[12]，將22 ℃浸種的蕓豆種子取出，并用吸水紙把水吸干后稱重。重復(fù)3次，計算平均值。

吸水量(%)=(m1-m0)/m0×100%；

吸水速率(%)=(m1-m0)/t×100%[13]。

式中：m1為浸種后質(zhì)量；m0為浸種前質(zhì)量；t為浸種時間。

1.3.3 種子萌發(fā)試驗

參照宋松泉等[14]的發(fā)芽法。記錄17，22，27 ℃等3個不同溫度下培養(yǎng)5 d時蕓豆種子的發(fā)芽率、每天新出芽數(shù)，以種子吸水始至種子出現(xiàn)0.5 cm胚芽時為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)3次，計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)：

發(fā)芽率(%)=(種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)[15]。

1.3.4 蕓豆種子水溶性蛋白的測定

以種子處理當(dāng)天為原點，第3、4、5、6、7、8天測定22 ℃培養(yǎng)下的蕓豆種子中水溶性蛋白和游離氨基酸含量。水溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[16]，游離氨基酸含量參照植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[17]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2010軟件作圖、DPS 7.5軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子吸水規(guī)律

采用稱量法分別對4種蕓豆種子的吸水量和吸水速率進行測定，結(jié)果見圖1和圖2。

從圖1可以看出，4種蕓豆種子的吸水量變化趨勢基本一致，皆隨著浸種時間的增加而增加。結(jié)合圖2可知，浸種12 h分3個階段，第1階段在1～2 h期間，其吸水量增加，吸水速率急劇下降，此過程是物理吸水，其中187-88、191-92蕓豆的吸水量、吸水速率大于05-04、92-94蕓豆，可能是其百粒重大于05-04、92-94蕓豆，所以種子需水量也大；第2階段在2～10 h期間，種子的吸水速率下降，其中05-04蕓豆的變化平緩，92-94蕓豆在2～8 h期間吸水速率急速下降，在8～10 h內(nèi)下降開始平緩，187-88、191-92蕓豆到了2～3 h時下降平緩，3～5 h期間吸水速率下降急速，8～10 h時開始上升，但種子的吸水量是增加的，這個過程是緩慢吸水階段；第3階段在10～12 h期間，吸水量和吸水速率再次增加，此階段是種子重新快速吸水階段。

圖1 4種蕓豆種子的吸水量

圖2 4種蕓豆種子吸水速率

2.2 種子在3種不同溫度下的萌發(fā)情況

在17，22，27 ℃下4種蕓豆種子的發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，4種蕓豆種子隨溫度的升高，表現(xiàn)不一致。05-04蕓豆在3個溫度下的發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)均高于其余3種蕓豆，則05-04蕓豆適種的溫度范圍可能比其余3種蕓豆要廣。結(jié)合圖2可知，05-04蕓豆的吸水速率變化波動平緩，其蕓豆的百粒重較小，對水分利用率較高[18]。92-94蕓豆27 ℃的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為60%和3.25，皆小于在22 ℃萌發(fā)時的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，這可能是選種好壞造成的影響。187-88蕓豆發(fā)芽指標(biāo)隨溫度的升高而升高。22 ℃萌發(fā)的191-92蕓豆發(fā)芽率低于17 ℃萌發(fā)時，可能原因為該蕓豆的萌發(fā)時間大于該次試驗選定的5 d，或是由選種差異而致。蕓豆的最適生長溫度為20～25 ℃，溫度高或低于20～25 ℃，不利于蕓豆的結(jié)莢，所以挑選22 ℃作為蕓豆水溶性蛋白和游離氨基酸測定的培養(yǎng)溫度。

表2 4種蕓豆種子在3種不同溫度下的萌發(fā)情況

品種溫度(℃) 17 22 27 發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)05-04100a5.00a100a6.33a100a9.73a92-9455c2.16b67b4.00ab60b3.25b187-8860c1.76d80b3.07b95a4.25b191-9275b1.99c45c3.77b80ab3.92b

注：表中小寫字母表示在0.05水平下差異性顯著。

2.3 種子水溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍(lán)法測定4種蕓豆種子的水溶性蛋白含量。由圖3可以看出，4種蕓豆種子在萌發(fā)的3～4 d水溶性蛋白含量變化平緩，此期間蕓豆種子萌發(fā)供能，消耗其水溶性蛋白，所以水溶性蛋白含量普遍較低；在4～5 d水溶性蛋白含量劇增，是種子新合成水溶性蛋白，在第5天時達到最大值，4種蕓豆種子水溶性蛋白含量分別為0.18，0.13，0.15，0.15 g/g；5～6 d以后水溶性蛋白含量又急速減少，此階段是種子將其水溶性蛋白消耗用于種子的萌發(fā)；在6～8 d時又恢復(fù)到變化平緩期，種子到萌發(fā)的后期，將不再過多合成新的水溶性蛋白，且不會單一消耗水溶性蛋白，所以其含量變化平緩。

圖3 4種蕓豆種子的水溶性蛋白含量

2.4 種子中游離氨基酸含量

用茚三酮法測定4種蕓豆種子氨基酸含量結(jié)果如圖4所示。由圖4可看出，4種蕓豆種子在萌發(fā)前期游離氨基酸含量有緩慢的增加，后期游離氨基酸含量開始下降，其中05-04蕓豆在萌發(fā)的第5天出現(xiàn)峰值，其游離氨基酸含量為239.33 mg/g，其他3種蕓豆種子在萌發(fā)的第7天出現(xiàn)峰值。結(jié)合圖3可知，3～4 d時水溶性蛋白的含量開始緩慢的合成增加，而種子的萌發(fā)需要消耗水溶性蛋白，水溶性蛋白被降解成小分子的氨基酸，所以其含量增加；第4～7天(萌發(fā)的后期)，新的蛋白開始合成，種子不再單一的消耗水溶性蛋白，所以在種子水溶性蛋白含量平緩時，游離的氨基酸含量還在增加，其中05-04蕓豆在4～5 d時就開始了急劇的增加，原因可能是其發(fā)芽較快，與其它3種蕓豆長勢不一致，92-94蕓豆在4～7 d其游離氨基酸含量也在急速增加；到了第7～8天，游離氨基酸的含量變化開始減緩，原因是種子合成新的蛋白，并非水溶性蛋白，所以氨基酸的含量開始下降。

圖4 4種蕓豆種子游離氨基酸的含量

3 討論與展望

種子萌發(fā)可分為吸脹、萌動、發(fā)芽3個過程[19]。吸水膨脹是種子萌發(fā)的起始階段[20]，種子吸水可以分為急劇、緩慢、停滯3個吸水時期。本試驗中4種蕓豆種子在吸脹1～2 h期間，種子的吸水量急劇增加；2～10 h期間，種子的吸水量增加，吸水速率減少；第3階段在10～12 h期間，種子的吸水量又再一次增加，此吸水變化與李淑艷等[21]的研究結(jié)果不符合(其提出的大豆吸水的變化為慢—快—慢的變化趨勢)，卻與劉冰等[15]的研究結(jié)果相符。對于22 ℃以外的其他溫度下蕓豆的吸水情況以及蕓豆種子吸水過程中具體的生理變化還有待進一步的研究。

種子活力最直觀的是其發(fā)芽率[22]，對多數(shù)的植物而言，種子僅需充足的水分等條件就能發(fā)芽[23]，溫度對種子的發(fā)芽率有不同影響[24]，本試驗中，4種蕓豆種子的發(fā)芽指標(biāo)皆隨溫度升高而升高，與周澤[25]的研究結(jié)論相一致。在17，22，27 ℃ 3個不同溫度培養(yǎng)下，92-94蕓豆27 ℃培養(yǎng)時的發(fā)芽指數(shù)小于22 ℃培養(yǎng)時的數(shù)值，以及191-92蕓豆22 ℃的發(fā)芽率小于17 ℃的發(fā)芽率，可能原因為種子自身原因，分為2種： 1) 外源因素，即胚以外的各種組織、種殼的限制； 2) 內(nèi)源因素，即胚的自身原因，包含胚的形態(tài)發(fā)育未完成、必需激素的缺少等。有學(xué)者還認(rèn)為，種子儲藏期間的代謝、收獲期前后和貯藏期的高溫、高濕等因素會造成種子的劣變，種子活力便下降。本試驗是在暗環(huán)境以及17，22，27 ℃等3種溫度下進行萌發(fā)，對于其他條件下蕓豆種子的發(fā)芽情況有待于進一步的研究。

蕓豆種子在萌發(fā)過程中，蛋白含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，此結(jié)果與王倩雯[6]的研究相符。此趨勢可能是萌發(fā)前的浸種，使得種子中的可溶性氮溶于水中，或是種子萌發(fā)需要消耗部分蛋白造成的結(jié)果。生物體在萌發(fā)生長的過程中會分解和合成蛋白質(zhì)，豆類種子貯藏蛋白主要是鹽溶蛋白和水溶蛋白為主[26]。種子萌發(fā)前期水溶性蛋白含量普遍較低，是種子萌發(fā)時消耗蛋白質(zhì)，其呼吸作用開始增強，酶促反應(yīng)開始進行，蛋白質(zhì)降解在蕓豆種子的局部區(qū)域造成的結(jié)果。種子幼胚發(fā)育和呼吸作用將消耗貯藏蛋白，隨萌發(fā)時間延長，種子蛋白含量會逐漸增加。其緣由是貯藏蛋白在萌發(fā)期間被分解成游離氨基酸，隨后種子將其運轉(zhuǎn)到生長部位，形成新的水溶性蛋白質(zhì)，使得水溶性蛋白含量再次增加 ，后期的種子萌發(fā)將其消耗后，水溶性蛋白含量又降低[27]。本試驗結(jié)果也與此相符，在蕓豆種子萌發(fā)的4～5 d時，蕓豆種子的可溶蛋白含量逐漸上升；在5～6 d期間，開始逐漸降低，但是在其水溶性蛋白的種類及含量上未進行鑒定和研究。

蕓豆在萌發(fā)時，貯藏蛋白先進行分解，非水溶性的蛋白要先被分解成分子量較小的水溶性蛋白。隨著種子的萌發(fā)，可溶性蛋白被完全的氨基酸化，游離氨基酸含量增加，種子將其運輸?shù)缴L部分，以不同結(jié)合方式形成新的蛋白質(zhì)。在此過程中，有些氨基酸進行了氨基化等反應(yīng)，形成新氨基酸后，再合成新的蛋白質(zhì)，所以游離氨基酸總量下降。

4 結(jié) 論

本試驗的4種蕓豆種子吸水量隨浸種時間增加而增加，但吸水速率呈快—慢—快的變化趨勢；4種蕓豆種子的發(fā)芽指標(biāo)隨溫度升高而升高，其水溶性蛋白及游離氨基酸含量先增加后下降，在萌發(fā)的第5天水溶性蛋白含量達到最大，4種蕓豆種子水溶性蛋白含量分別為0.18，0.13，0.15，0.15 g/g。