馮培祥，楊 莉，趙付偉，姜桂苗，高維平，嵇傳良

(1. 國(guó)家膠類(lèi)中藥工程技術(shù)研究中心，山東 東阿 252201；2.東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿 252201)

沙門(mén)菌(Salmonella)屬腸道菌科，是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相類(lèi)似的重要腸道菌。其已確認(rèn)的血清型超過(guò)2 500種[1]。沙門(mén)菌病是具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義的人獸共患病病原菌。Mcllory[2]等報(bào)告，日、美等發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)生食物中毒的事件中40%～80%是由禽沙門(mén)菌引起的，其中主要病原為腸炎沙門(mén)菌。佘容[3]等報(bào)道，沙門(mén)菌極易通過(guò)直接或間接途徑在人和動(dòng)物之間傳播，無(wú)中間宿主。人畜感染沙門(mén)菌后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，降低動(dòng)物繁殖力，或加重病情及死亡率，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死性疾病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅人的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。其來(lái)源主要是患病的人和動(dòng)物及帶菌者通過(guò)糞便、尿、乳汁及流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水等排出，污染水源、土壤和飼料等[3]。本病常發(fā)生于豬、雞、牛等動(dòng)物，而關(guān)于馬屬動(dòng)物特別是驢的沙門(mén)菌病國(guó)內(nèi)報(bào)道很少。劉建國(guó)等[4]報(bào)道從一頭死亡驢的肝、脾、淋巴結(jié)中分離到沙門(mén)菌，確定其是驢死亡原因。作者通過(guò)檢測(cè)一例流產(chǎn)驢駒胎兒組織，并從中分離并鑒定出沙門(mén)菌，確定其是引起流產(chǎn)的致病菌。之后對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果為該病在臨床上的用藥選擇提供了依據(jù)，也為驢上沙門(mén)菌病的診斷與預(yù)防提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017年7月份，聊城某養(yǎng)驢廠母驢出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，采集一頭流產(chǎn)胎兒，對(duì)其進(jìn)行剖檢，采集了心、肝、脾、肺、腎等臟器。將采集的樣品保存于4 ℃環(huán)境中，在12 h 內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 pMD19-T載體、dNTP、TaqDNA 聚合酶、瓊脂糖、DL-2 000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥物 復(fù)方新諾明、諾氟沙星、慶大霉素、青霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素、氧氟沙星、四環(huán)素、潔霉素C、多黏菌素B、環(huán)丙沙星等藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備 賽默PCR基因擴(kuò)增儀(2720)、山東鑫科生物科技股份有限公司自動(dòng)生化/藥敏分析儀(XK型)、北京君意垂直電泳儀(JY300C)。上海一恒恒溫振蕩器(THZ98A)、湖南湘儀冷凍離心機(jī)(H1850R)、山東鑫科比濁儀(XK型)。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離及特性培養(yǎng) 無(wú)菌采集剖檢流產(chǎn)驢駒的肝臟、脾臟和肺臟、心臟及腎臟，通過(guò)三區(qū)劃線將上述臟器分別接種普通瓊脂平板、S.S.瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基平板，每一種臟器分別接種2份平板，1份進(jìn)行需氧培養(yǎng)，1份進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h 后觀察平板有無(wú)菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。參考文獻(xiàn)[5]方法檢測(cè)病變器官是否有病毒感染，將上述病變器官稱(chēng)重、研磨。按1∶5(W/V)比例加入PBS制成懸液，加入雙抗1 500 IU(μg)/mL，反復(fù)凍融 3～4次，離心取上清液并過(guò)濾接種至犢牛睪丸細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，并將細(xì)胞染色后于電鏡下觀察。

1.2.2 分離菌生化鑒定 按照山東鑫科生化鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，上機(jī)通過(guò)其自動(dòng)生化儀(XK型)進(jìn)行鑒定，通過(guò)生化儀自動(dòng)判讀結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 參照CLSL(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[6]，參照趙戰(zhàn)鋒[7]等的方法，將分離純化的2株細(xì)菌，接種于普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌液，通過(guò)比濁儀將菌液稀釋成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，吸取200 μL菌液于MH培養(yǎng)基平板內(nèi)，在其表面涂布均勻，蓋上平板，于37 ℃放置5 min，然后取回在超凈臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌小鑷子夾取各種藥敏紙片，平貼于瓊脂表面，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，平板取出后，觀察藥敏紙片周?chē)袩o(wú)抑菌圈形成，測(cè)量其直徑(mm)大小。每株細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)重復(fù)。參考羅玲[8]等報(bào)道方法進(jìn)行結(jié)果判定： 直徑>15 mm 為高度敏感；10.1 mm<直徑≤15 mm為中度敏感；直徑≤10 mm 為耐藥。

1.2.4 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化分析 將2株分離菌接種于普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，采用苯酚-氯仿法抽提分離菌株基因組DNA。自行設(shè)計(jì)16S rRNA上游引物F：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物R：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′。PCR反應(yīng)體系為30 μL，即ddH2O 19 μL、10×Buffee 5 μL、dNTP Mix 2.5 μL、Taq酶 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL(引物濃度為40 pmmol/μL)、DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果，并用膠回收試劑盒回收純化 PCR 產(chǎn)物。純化的目的片段與 pMD19-T 載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) PCR 鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序并命名為A1、A2。

將上述2株分離菌的16S rRNA 基因序列通過(guò)NCBI的Blast 檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列的同源性分析，使用軟件從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的沙門(mén)菌的16S rRNA 序列進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建分支系統(tǒng)樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 分離菌培養(yǎng)特征及形態(tài)觀察 分別從流產(chǎn)驢駒肝、肺內(nèi)分離到2株細(xì)菌，分別命名為A1、A2，未分離到其他細(xì)菌。該分離菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落邊緣整齊，表面光滑，半透明。小凸起。在S.S.培養(yǎng)基上呈無(wú)色透明，菌落中心有黑色圓點(diǎn)。其在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出表面光滑、半透明的圓形菌落。2株分離菌革蘭染色為陰性，桿狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，有鞭毛。散在或個(gè)別成排排列，菌體體積大小約為0.6～1.0×2～3 μm。

病變肝肺組織研磨懸浮上清液接種于犢牛睪丸細(xì)胞后，未出現(xiàn)病變，鏡檢也未發(fā)現(xiàn)病毒顆粒。

2.2 分離菌生化反應(yīng)結(jié)果 將2株分離株于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h 后，于超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌生理鹽水將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛?，按照山東鑫科生物科技股份有限公司細(xì)菌生化鑒定測(cè)試試劑盒(XK-24A-C)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，2株分離菌生化反應(yīng)結(jié)果一致，均符合沙門(mén)菌生化特性。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)2株分離菌的抑菌圈大小進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示，2株分離菌的藥物敏感性基本一致，取其平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

“+”陽(yáng)性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)

表2 2株分離株的藥物敏感性(平均值)

R 耐藥；I 中度敏感；S 敏感

2.4 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化分析 提取2株分離菌的DNA后，對(duì)其16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，在1 500 bp處有目的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果相一致(圖1)。 測(cè)序結(jié)果顯示，2株分離菌的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度均為1 560 bp，將2株分離菌16S rRNA基因序列與GenBank 核算數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，其結(jié)果與沙門(mén)菌的16S rRNA 基因自然聚類(lèi)，將分離株分別與 GenBank收錄的沙門(mén)菌通過(guò)DNAStar進(jìn)行同源性分析，并繪制成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，2株分離株核苷酸序列之間的同源性為98.6%，與GenBank收錄的其他腸炎沙門(mén)菌EU073020.1、MF521947、MF682400同源性分別為99.4%、99.3%、97.7%。與GenBank收錄的霍亂沙門(mén)菌DQ344535、NZ_MYYB01000065、NZ_MYYT01000080同源性分別為99.6%、96.3%、44.5%。與GenBank收錄的傷寒沙門(mén)菌AB855736、JQ284055.1、KX232359、MG270582同源性分別為97.3%、96.9%、89.4%、98.1%。與GenBank收錄的鼠傷寒沙門(mén)菌JN254642、KY750226同源性分別為96.9%、95.9%。與GenBank收錄的亞利桑那沙門(mén)菌AB273736、KX082838、NR_116125同源性分別為97.5%、97.4%、98.1%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，2株分離菌處于同一分支，且與霍亂沙門(mén)菌DQ344535最近、與腸炎沙門(mén)菌MF521947、EU073020.1遺傳距離較傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌的其他分離株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 2株分離菌16S rRNA目的基因的PCR結(jié)果

1：陰性對(duì)照； 2：A1； 3：A2； M：DL-2 000 Marker

圖22株分離菌16SrRNA基因序列的同源性

圖3分離菌16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本試驗(yàn)從流產(chǎn)驢駒的肝臟與肺臟分離到2株革蘭陰性桿菌，經(jīng)生化鑒定為沙門(mén)菌，將所得菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用Blast 進(jìn)行同源性比較，分離株與霍亂沙門(mén)菌的同源性最高為99.6%。除了傳統(tǒng)的分離鑒定及生化鑒定以外，本試驗(yàn)選取了保守的16S rRNA基因并結(jié)合基因測(cè)序手段實(shí)現(xiàn)了沙門(mén)菌的診斷。16S rRNA基因?yàn)榧?xì)菌高度保守基因，具有細(xì)菌種、屬特征，已被用作細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)的目的基因，是一種對(duì)細(xì)菌分類(lèi)鑒定快速、準(zhǔn)確的方法[9]。據(jù)報(bào)道[10-11]沙門(mén)菌可以引起妊娠并發(fā)癥，比如絨毛膜羊膜炎、經(jīng)胎盤(pán)的胎兒感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)、新生兒和產(chǎn)婦敗血癥。據(jù)Noto[12]等報(bào)道，低劑量的腸炎沙門(mén)菌可以導(dǎo)致懷孕后期鼠模型母體感染，導(dǎo)致40%早產(chǎn)和33%流產(chǎn)以及胎兒的生長(zhǎng)緩慢。

沙門(mén)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)在豬、雞、鴨上等報(bào)道較多[13-14]。在馬屬動(dòng)物特別是驢上報(bào)道較少。加春生[12]等報(bào)道，其從豬糞便中分離出的沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林100%耐藥；對(duì)頭孢西丁哌拉西林、頭孢噻肟等藥物存在不同程度的耐藥；對(duì)碳青霉烯類(lèi)敏感。王傲雪[13]等報(bào)道的其對(duì)26株沙門(mén)菌進(jìn)行分離鑒定后，對(duì)5株強(qiáng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，5株沙門(mén)菌對(duì)頭孢噻肟較為敏感。對(duì)氨芐西林、替米考星、林可霉素、阿奇霉素和頭孢拉定表現(xiàn)極高的耐藥性，耐藥率達(dá)100%。吳新明[15]等報(bào)道的其分離鑒定38株鴨源沙門(mén)菌對(duì)21種抗生素均有不同程度的耐藥，并以多重耐藥為主，耐藥性差異大，最為敏感的抗生素是磷霉素和阿米卡星兩種藥物。通過(guò)上述報(bào)道可見(jiàn)，沙門(mén)菌在豬、雞、鴨上均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，提示上述動(dòng)物在規(guī)?；B(yǎng)殖過(guò)程中，在獸藥廣泛的使用的同時(shí)，耐藥菌株也隨之出現(xiàn)。本試驗(yàn)中2株沙門(mén)菌分離株對(duì)大部分藥物具有敏感性，尤其對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物(氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星)、復(fù)方新諾明敏感；對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、多黏菌素中敏；對(duì)青霉素、頭孢氨芐、紅霉素、克林霉素有耐藥性。推測(cè)可能在馬屬動(dòng)物特別在驢上傳染病與臨床用藥較少，故分離株對(duì)大多數(shù)藥物敏感。由于驢的繁殖周期較長(zhǎng)和用驢作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本較高、試驗(yàn)周期較長(zhǎng)等原因，本試驗(yàn)的不足之處在于未進(jìn)行分離株回歸本源動(dòng)物試驗(yàn)。