王 強(qiáng)，程 潔，梁 毅，羅 強(qiáng)，王朝明，黃 利，吳 青

(1.重慶市壁山區(qū)養(yǎng)殖業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，重慶 壁山 402760；2.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

大鯢，俗名“娃娃魚”，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科。是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，是國家特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開發(fā)生態(tài)養(yǎng)殖品種。具有可食用、 藥用 、觀賞 、科研等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的興起與發(fā)展，大鯢的人工養(yǎng)殖已成為具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)業(yè)，但是，各種養(yǎng)殖病害問題也隨之而來，成為制約大鯢養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展的重要原因之一,給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

中藥是指在中國物性理論 (陰陽五行學(xué)說)指導(dǎo)下用于防治人和動(dòng)物疾病、促進(jìn)健康、 提高生產(chǎn)性能和動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量的天然物質(zhì)，我國擁有豐富的中藥資源，在漁業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐使用上，中藥有著悠久的使用歷史。研究顯示，中藥有著多方面的免疫活性物質(zhì)，能影響和調(diào)節(jié)動(dòng)物體免疫功能，提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病力[1]，減少魚體感染疾病的幾率。使用中藥于水產(chǎn)養(yǎng)殖防治魚病不僅解決了化學(xué)藥物的殘留和產(chǎn)生抗藥性等問題，而且對(duì)于發(fā)展綠色養(yǎng)殖，生產(chǎn)綠色無公害水產(chǎn)品，提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效益等方面有著顯著的效果。

2008年4月，重慶開縣的某個(gè)大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)了體表出現(xiàn)大量血點(diǎn)及出血現(xiàn)象，在身體腹部，兩側(cè)和尾部較明顯，身體體表分泌大量白色黏液，病程較長的伴有四肢端部潰爛，大鯢不吃食。剖檢觀察其脾臟出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)，并常伴有瘀血斑和壞死病灶，有的胃、腸道脹氣，腸壁充血潰爛，有的伴有紅色或乳白色的腹水，有的心臟瘀血肝臟有的出現(xiàn)瘀血、變性和壞死，有的肺出現(xiàn)發(fā)黑變性病灶，有的直腸末端出現(xiàn)發(fā)黑變性病灶(見中插彩版圖1)。其后在四川一些養(yǎng)殖場(chǎng)也陸續(xù)出現(xiàn)此病。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。查閱了有關(guān)的文獻(xiàn)，根據(jù)其作用機(jī)理，篩選了幾種中藥，通過采取中西結(jié)合的防治措施，大鯢的體質(zhì)有所增強(qiáng)，病情得到了有效的控制。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥配方：大青葉，連翹，穿心蓮，黃芪，大黃，黃連，杜仲粉，金銀花，脯骨脂，黨參，板藍(lán)根。

試驗(yàn)試劑：姬姆薩染液 酸性磷酸酶測(cè)定試劑盒，一氧化氮和酶測(cè)定試劑盒，氯化鈉溶液，枸櫞酸鈉溶液。

試劑配制：紅細(xì)胞稀釋液：氯化鈉0.6 g，加蒸餾水100 mL溶解，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

白細(xì)胞稀釋液：枸櫞酸鈉3 g，加中性甲醛 1 mL，蒸餾水定容至100 mL，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

1%肝素鈉：肝素鈉1 g，加0.6%生理鹽水100 mL，漩渦震蕩使之溶解，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：冰箱 恒溫水浴鍋，小型離心機(jī)，顯微鏡，分光光度計(jì)，全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)前對(duì)所有試驗(yàn)池、工具，用高錳酸鉀進(jìn)行消毒處理。根據(jù)養(yǎng)殖條件，選擇4個(gè)養(yǎng)殖池，以每2個(gè)池分為1組，2組，然后進(jìn)行編號(hào)，其中1號(hào)為對(duì)照組，其余為試驗(yàn)組，對(duì)隨機(jī)選取患病大鯢80尾，計(jì)量體重，隨機(jī)分配至4個(gè)養(yǎng)殖池中，記錄娃娃魚患病特征，飼養(yǎng)環(huán)境保持一致。根據(jù)該養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖管理習(xí)慣以及大鯢的攝食習(xí)慣，試驗(yàn)組的大鯢取用熬制好的濃縮中藥湯劑對(duì)患病大鯢進(jìn)行灌服操作，每日用量(0.8 mL/kg·bw),1次/d；本試驗(yàn)采用自身對(duì)照，故不設(shè)對(duì)照組。灌藥后對(duì)病鯢的恢復(fù)情況進(jìn)行記錄，每15天拍照1次，選出有代表性的進(jìn)行比較。

1個(gè)療程后，兩人配合進(jìn)行，隨機(jī)對(duì)每個(gè)魚池挑選1條進(jìn)行采血，采取的血液放入加了肝素鈉的EP管中4 ℃保存。

將放置在冰箱中保存的EP管取出，靜置1 min，然后在3 000 r/min離心10 min，取上層液使用，剩余液體放入冰箱保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清中的酸性磷酸酶(ACP)以及一氧化氮合酶(NOS)的測(cè)定、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測(cè)定。

1. 3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的ANOVA軟件進(jìn)行方差分析和均值多重比較法處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 灌藥前后大鯢的恢復(fù)情況對(duì)比 灌藥前，大鯢體表背部出現(xiàn)潰爛，四肢、尾部發(fā)生腫大、潰爛甚至出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象，灌藥后大鯢背部、四肢及尾部的潰爛面逐漸縮小，患病大鯢體表不再出現(xiàn)紅腫、潰爛等情況，身體腹部及背部的潰爛情況有明顯的好轉(zhuǎn)，但是有極個(gè)別的恢復(fù)情況不是太明顯，綜合死亡的個(gè)數(shù)逐漸降低，病情得到了相對(duì)有效的控制，治愈率達(dá)到82.8%。

2. 2 患病大鯢灌藥前后的血液生理指標(biāo)的比較分析

2. 2.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 通過顯微觀察大鯢血涂片，對(duì)血液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其結(jié)果見表1 。由方差分析得出，與灌藥后比較，患病大鯢灌藥前的白細(xì)胞數(shù)目顯著性高于灌藥后(P<0.05),紅細(xì)胞數(shù)目差異不顯著(P>0.05)。

表1 患病大鯢灌服中藥前后血細(xì)胞數(shù)量變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2.2 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 通過對(duì)血涂片的觀察，白細(xì)胞的分類比例如表2所示。方差分析表明，相比較灌藥前，患病大鯢的嗜中性粒細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05)，淋巴細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05)，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞變化比例不顯著(P>0.05)

表2 患病大鯢灌服中藥前后白細(xì)胞分類比例變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2.3 患病大鯢灌藥前后生化指標(biāo)的比較 通過開縣博愛醫(yī)院對(duì)大鯢血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢驗(yàn)報(bào)告單進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。由方差分析顯示，相對(duì)于灌藥前，患病大鯢在灌藥后血清指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著性下降(P<0.05)。

通過用一氧化氮合酶(NOS),酸性磷酸酶(ACP)試劑盒對(duì)患病大鯢血清酶的檢測(cè)，所得結(jié)果如下表。相比較灌藥前，灌藥后患病大鯢的一氧化氮合酶及酸性磷酸酶活性顯著下降(P<0.05)。

表3 患病大鯢灌服中藥前后生化指標(biāo)變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討論

3.1 結(jié)節(jié)病致病菌對(duì)于大鯢的各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響 紅細(xì)胞是血液中最多的一類血細(xì)胞，主要功能是運(yùn)輸氧氣和代謝二氧化碳，使機(jī)體生命活動(dòng)正常。魚類的紅細(xì)胞數(shù)在一定程度上能反映魚體的健康狀況[2]。目前，關(guān)于水生動(dòng)物患病后的血液紅細(xì)胞數(shù)目變化的研究，數(shù)據(jù)各有不同?；疾【C合征的石斑魚的血液紅細(xì)胞數(shù)相對(duì)于正常魚高23.79%[3]。感染嗜水汽單胞菌的香魚血液紅細(xì)胞數(shù)目顯著降低[4]。本試驗(yàn)中，中藥灌服患病大鯢前后，血液紅細(xì)胞數(shù)目變化不顯著(P>0.05)，表明結(jié)節(jié)病致病菌對(duì)大鯢的紅細(xì)胞數(shù)目變化差異不顯著(P>0.05)。

白細(xì)胞具有免疫防御功能，它通過吞噬細(xì)胞吞噬有害物質(zhì)以及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體來免疫調(diào)節(jié)機(jī)體。一般來說，魚在發(fā)病后，其血液中的白細(xì)胞數(shù)目會(huì)上升。患肌肉潰爛病的中華倒刺鲃[5]的白細(xì)胞數(shù)目顯著性上升，當(dāng)疾病較為嚴(yán)重時(shí)，魚體的造血功能和免疫功能損傷嚴(yán)重，則變?yōu)榘准?xì)胞數(shù)目下降?；既茉寤【镊|魚[6]病發(fā)后期，白細(xì)胞數(shù)目下降。本試驗(yàn)中，大鯢患脾臟結(jié)節(jié)病后，血液生理生化指標(biāo)表現(xiàn)為嗜中性粒細(xì)胞比例顯著性上升(P<0.05)，表明大鯢的細(xì)胞吞噬能力較強(qiáng)，淋巴細(xì)胞比例顯著性下降(P<0.05)，機(jī)體免疫能力較弱，單核細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞比例變化不大。

正常情況下血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性低且較為穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體患病導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受損時(shí)[7]，該類酶被釋放到血清中，導(dǎo)致這兩種酶的活性在組織中降低而在血液中升高?；既茉寤【〉幕|[6]血清中AST、ALT的含量上升，認(rèn)為是肝臟組織受損，致使血液中血清酶的含量上升。本試驗(yàn)中，大鯢患結(jié)節(jié)病后血清中ALT、AST含量顯著上升，表明大鯢在結(jié)節(jié)病致病菌的作用下，肝臟組織受到損傷。

酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合酶(NOS)是存在于血液中參與非特異性的免疫相關(guān)酶[2]，在機(jī)體的免疫防御過程中起了十分重要的作用。研究表明，一氧化氮參與機(jī)體的免疫，能夠殺滅細(xì)菌和病毒。大鯢在患病后血液中一氧化氮合酶的活性顯著性升高。酸性磷酸酶(ACP)能促進(jìn)病原物質(zhì)在溶酶體內(nèi)的消化降解。日本鰻鱺感染嗜水氣單胞菌后，通過提高血清中ACP活力達(dá)到快速殺菌的目的。本試驗(yàn)中，大鯢患結(jié)節(jié)病后，ACP的活性升高。

3.2 中藥對(duì)于患結(jié)節(jié)病的大鯢的影響 比較灌藥前后的大鯢的血液生理生化指標(biāo)。相對(duì)于灌藥前，灌藥后的病鯢的血清中嗜中性粒細(xì)胞比例顯著性下降，淋巴細(xì)胞比例顯著性的上升，表明大鯢在灌藥后，以嗜中性粒細(xì)胞為主要非特異性免疫防御功能減弱。以淋巴細(xì)胞為主的免疫功能逐漸恢復(fù)。此外，患病大鯢血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性相對(duì)于灌藥前，顯著性下降(P<0.05)，表明肝臟的受損程度在灌藥后逐漸減小，其功能得到了恢復(fù)。另外，灌藥后，患病大鯢的NOS、ACP活性顯著性下降，表明以吞噬細(xì)胞為 主的非特異性免疫應(yīng)答激活程度逐漸降低，大鯢魚體免疫能力有所提高，大鯢病情得到了有效控制。表明本研究所篩選的幾種中藥在一定程度上對(duì)大鯢的病情有一定的抑制作用。