李迎賓 曹永松 羅來鑫 張治萍 李健強(qiáng)

摘要

異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）是十字花科植物的組成型代謝產(chǎn)物之一，關(guān)于其天然抗菌殺蟲活性，以及在人類醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用已有大量研究。本文重點(diǎn)對(duì)AITC的制備、農(nóng)用活性及殘留、安全性及作用機(jī)制研究等方面進(jìn)行綜述，以期為AITC在農(nóng)業(yè)中的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞

異硫氰酸烯丙酯; 抗菌活性; 農(nóng)用活性; 作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：

S 436.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018324

Research progresses on the anti-microbial activity and

application of allyl isothiocyanate in agriculture

LI Yingbin， CAO Yongsong， LUO Laixin， ZHANG Zhiping， LI Jianqiang

（College of Plant Protection， Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and

Control （BKL-SDTC）， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

Allyl isothiocyanate， as an important constructive metabolite from cruciferous plants， has a broad biological activity and has been widely studied and applied in the fields of human medicine， agriculture， food science，et al. This review summarized the agricultural bioactivity and application of allyl isothiocyanate， including the preparation of AITC， agricultural activity， residue， safety and mechanism. The purpose of this paper is to provide more theoretical and technical support for the development and application of AITC in agricultural production.

Key words

allyl isothiocyanate; biological activity; agricultural activity; mechanism of AITC

依賴化學(xué)農(nóng)藥控制農(nóng)作物病蟲害具有悠久的歷史[1]。熏蒸劑作為合成化學(xué)農(nóng)藥的一種，在防控土傳、倉(cāng)儲(chǔ)、采后病蟲害及食品保鮮等領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用。隨著人們消費(fèi)水平及對(duì)食品安全的重視程度的提高，研究開發(fā)高效、無毒、無殘留的病蟲害防治措施及食品保鮮手段備受關(guān)注和重視。1937年Walker等報(bào)道十字花科蕓薹屬植物，如芥菜、甘藍(lán)中的硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡(jiǎn)稱GSLs）的降解產(chǎn)物異硫氰酸酯類化合物（isothiocyanates，簡(jiǎn)稱ITCs）具有天然抗菌活性[2]和廣譜滅生性[3]，其中異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）作為主要降解產(chǎn)物，對(duì)多數(shù)植物病原真菌[4]、細(xì)菌[5]、線蟲及昆蟲[6]具有活性。同時(shí)，對(duì)一些人類致病菌，如大腸桿菌Escherichia coli、鼠傷寒沙門氏桿菌Salmonella typhimurium、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、幽門螺旋桿菌Helicobacter pylori、念珠菌屬Candida sp.等同樣具有生物活性[7]。除此之外，AITC在抗癌、心肌保護(hù)及神經(jīng)保護(hù)等方面的效果和作用也受到關(guān)注[8-9]。

1 異硫氰酸烯丙酯及其制備工藝

1.1 異硫氰酸烯丙酯概述

異硫氰酸烯丙酯（AITC，俗稱為辣根素）是一類廣泛存在于辣根、芥菜和山葵等十字花科蔬菜中的天然含硫次生代謝物，是ITCs類物質(zhì)的主要種類;其在人類醫(yī)學(xué)、食品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，基于ITCs類物質(zhì)所申請(qǐng)的部分專利及農(nóng)藥登記報(bào)道見表1。

表1 國(guó)際上關(guān)于ITCs類物質(zhì)在相關(guān)領(lǐng)域申請(qǐng)專利及登記情況

Table 1 Application and registration of ITCs in the world

辣根素的前體為存在于植物液泡中的GSLs物質(zhì)，一旦將植物組織破碎，GSLs便在黑芥子酶的催化作用下水解[10]。不同十字花科植物GSLs水解產(chǎn)物不同。Jiang等采用GC-MS方法，共檢測(cè)出我國(guó)辣根中含有的9種揮發(fā)性ITCs物質(zhì)，名稱及含量分別為異硫氰酸異丙酯（isopropyl isothiocyanate，isopropyl ITC，含量0.1%）、異硫氰酸烯丙酯（AITC，含量78.4%）、異硫氰酸丁酯（butyl isothiocyanate，butyl ITC，含量0.1%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（3-butenyl isothiocyanate，3-butenyl ITC，含量1.5%）、2-異硫氰酸戊酯（2-pentyl isothiocyanate，2-pentyl ITC，含量2.1%）、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，phenyl ITC，含量0.1%）、3-（甲基硫代）丙基硫代異氰酸酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，3-methyl ITC，含量0.3%）、異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，benzyl ITC，含量0.1%）、β-異硫氰酸苯乙酯（β-phenylethyl isothiocyanate，β-phenylethyl ITC，含量9.4%）。其中，AITC為我國(guó)辣根含有的ITCs類物質(zhì)的主要成分，其含量高于英格蘭辣根、匈牙利辣根和日本辣根（44.3%～55.7%）[11-12]。

1.2 AITC的制備

AITC的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為CH2=CHCH2N=C=S，分子量99.16，沸點(diǎn)為152℃，凝固點(diǎn)-80℃，密度為1.012 6 g/mL。常溫下為淡黃色透明油狀液體，具有強(qiáng)烈的揮發(fā)性，其制備主要有以下兩種途徑。

1.2.1 從十字花科植物中提取

一些蔬菜如甘藍(lán)中AITC的濃度大概在800～1 000 mg/kg[24]，芥菜種子中含有的AITC濃度最高，約為2 500～5 000 mg/kg。從辣根等十字花科植物中提取AITC的經(jīng)典方法是水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2流體萃取法。以辣根為例，Wu等[25]比較了水解時(shí)間、溫度、pH和添加劑抗氧化劑對(duì)于AITC前體的水解效果，最終發(fā)現(xiàn)采用20 mg/g抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚65℃水解120 min（pH=4）時(shí)AITC前體物質(zhì)水解程度最佳，以二氯甲烷作為萃取溶劑最優(yōu)，采用超臨界CO2液體萃取法產(chǎn)生的AITC產(chǎn)量為6.10%，高于水蒸氣蒸餾產(chǎn)率（5.83%）。鄭建秋等[26]將粉碎后的芥菜籽加入反應(yīng)釜容器中，采用50℃、pH為4.0～6.5的酸性水浸泡2 h，催化芥菜籽中的GSLs為異硫氰酸烯丙酯，采用亞臨界水萃取技術(shù)（2Mpa、120℃）對(duì)反應(yīng)釜中的物質(zhì)進(jìn)行萃取，然后分離反應(yīng)釜中的物質(zhì)，即得到含異硫氰酸烯丙酯的辣根素粗產(chǎn)物，產(chǎn)物中AITC含量為66.5%，產(chǎn)油率為2.3%。該制備過程不僅綠色安全，且易于操作，反應(yīng)歷程短，萃取率高。

1.2.2 仿生化學(xué)合成路徑

從十字花科植物中提取辣根素操作復(fù)雜，能耗過高，提取效率低，難以規(guī)模生產(chǎn)，因此AITC的化學(xué)合成備受關(guān)注[27]。目前AITC主要通過仿生合成進(jìn)行制備，其中具有工業(yè)化前景的合成途徑是以烯丙基鹵與硫氰酸鹽作為原料，通過液固非均相反應(yīng)及將溶劑改為乙醇后的均相反應(yīng)。國(guó)外團(tuán)隊(duì)如美國(guó)、俄羅斯（RUSS2321581）、日本（JP181053）、印度等均有關(guān)于AITC的合成工藝[28]。國(guó)內(nèi)王向輝等[29]選用l， 3-二溴丙烷、鄰苯二甲酰亞胺鉀、硫脲、二硫化碳及取代溴芐為原料，經(jīng)5步反應(yīng)合成了8個(gè)未見報(bào)道的辣根素類化合物。劉學(xué)勇等[27]綜述了國(guó)內(nèi)外主要的合成工藝，認(rèn)為李健強(qiáng)、曹永松團(tuán)隊(duì)等采用烯丙基胺、二硫化碳和雙氧水為主要原料的制備工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品收率達(dá)90%，含量達(dá)到97%，具有較大的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值[30]。

2 AITC的農(nóng)用活性

已報(bào)道，AITC具有廣譜高效的殺菌、殺線蟲、殺蟲作用活性（見表2）。同時(shí)因其來源于植物且具有很高的安全性，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（US EPA）也許可將其登記為風(fēng)險(xiǎn)較低的生物農(nóng)藥之一[31]。

表2 已報(bào)道的AITC具有活性的部分靶標(biāo)生物

Table 2 Reported target organisms of AITC

2.1 對(duì)土傳植物病原生物的活性

早期人們發(fā)現(xiàn)，芥菜籽、山葵、辣根等植物具有殺菌活性。Angus等發(fā)現(xiàn)將甘藍(lán)和芥菜等植物的碎粉深埋至土壤中，可以抑制小麥全蝕病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的生長(zhǎng)，并首次將這種方法稱為“生物熏蒸”[32]。由于連作或伴隨灌溉，土壤中的腐霉Pythium與疫霉Phytophthora等不斷在田間土壤環(huán)境中累積[33]，對(duì)此Weerakoon等[34]以芥菜種子糠（seed meal）改良土壤，建立了一種以“生物介導(dǎo)”的能夠長(zhǎng)期抑制病原菌積累的策略，有效地控制了蘋果園內(nèi)樹苗根腐病的發(fā)生[35]。研究揭示其中具有抑菌作用的成分是包括AITC在內(nèi)的多種ITCs類物質(zhì)。Mark等[36]研究表明，芥菜中的AITC在24～48 h內(nèi)即可完全釋放到土壤中。

作者團(tuán)隊(duì)的黃小威[37]、王彥檸等[38]研究表明，在熏蒸條件下AITC對(duì)供試的禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani等10余種植物病原真菌及瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、辣椒疫霉Phytophthora capsici等卵菌的菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，其EC50分布在0.94～24.64 μg/mL之間;對(duì)其中12種病原真菌的孢子萌發(fā)亦具有顯著抑制作用，EC50分布在0.26～0.69 μg/mL之間;試驗(yàn)證實(shí)，AITC能夠?qū)е鹿┰囃羵鞑≡婢奥丫鋽U(kuò)展速度減慢，氣生菌絲稀薄、孢子萌發(fā)率降低，病原細(xì)菌菌落數(shù)量減少、生長(zhǎng)速度減緩，對(duì)常見的植物病原菌呈現(xiàn)出廣譜、高效的抑菌活性，為辣根素熏蒸防控田間主要土傳病害提供了理論支持。

由大麗輪枝菌Verticillium dahliae引起的棉花黃萎病是一種重要的土傳植物維管束病害，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量[39]。作者團(tuán)隊(duì)的李慧[40]前期研究表明，20%辣根素水乳劑1 500倍稀釋液不僅對(duì)棉花黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，同時(shí)對(duì)棉花種子出苗和幼苗生長(zhǎng)具有安全性。劉政等[39]采用滴灌與覆膜施藥的方式，連續(xù)兩年對(duì)20%辣根素水乳劑防控棉花黃萎病的田間效果進(jìn)行研究，提出了該藥劑防控棉花黃萎病的使用技術(shù)規(guī)程，且在合作試驗(yàn)地區(qū)合計(jì)輻射應(yīng)用面積達(dá)到1.4萬hm2。

2.2 對(duì)果蔬地上部病蟲害靶標(biāo)生物的活性

王彥檸等[38]研究表明，AITC對(duì)番茄潰瘍病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis、十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv. campestris等5種植物病原細(xì)菌的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，EC50分布在0.81～8.61 μg/mL之間。

北京市近幾年來大力推廣使用AITC，建立了以蔬菜無病蟲育苗、產(chǎn)前消毒預(yù)防、產(chǎn)中綜合防控和產(chǎn)后殘?bào)w無害處理有機(jī)結(jié)合的“全程綠色防控”技術(shù)體系。目前，北京市蔬菜病蟲全程綠色防控示范基地?cái)?shù)量達(dá)到20 個(gè)，覆蓋了全市10 個(gè)區(qū)（縣），有效減少了病蟲危害程度和化學(xué)農(nóng)藥用量[41]。示范試驗(yàn)證實(shí)，20% 辣根素水乳劑對(duì)煙粉虱有很好的速效性，藥后3 d防效達(dá)到70.9%，且成本低廉，操作簡(jiǎn)便[42];采用滴灌施藥方法，發(fā)現(xiàn)其對(duì)土壤真菌中的鐮刀菌殺滅效果達(dá)到100%，對(duì)腐霉、曲霉、青霉等殺滅效果顯著;設(shè)施草莓土壤經(jīng)過辣根素消毒處理整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的植株成活率明顯提高[43]。天津市津南區(qū)植保部門通過滴灌系統(tǒng)把辣根素注入土地后覆蓋上一層密閉的厚膜，熏蒸處理3 d即可有效殺滅多種病蟲，按照操作規(guī)程定植蔬菜，一季不用再除草、除蟲，還能保證蔬菜的品質(zhì)[44]。王曉青等在生菜定植前7 d采用20%辣根素水乳劑以隨水滴灌方式對(duì)連續(xù)種植3年以上菌核病發(fā)生嚴(yán)重的生菜地進(jìn)行土壤熏蒸處理，定植后7 d使用抗重茬菌劑或使用寡雄腐霉灌根處理，對(duì)生菜菌核病防治效果可達(dá)到80%左右[45]。

2.3 對(duì)作物儲(chǔ)藏期病蟲害靶標(biāo)的生物活性

AITC因具有強(qiáng)烈的揮發(fā)性以及高效的抗微生物活性，且對(duì)多種食源性致病菌具有殺滅活性，研究者認(rèn)為可將AITC開發(fā)成一種新型的包裝策略，如作為“抗菌香囊（anti-microbial sachets）”防控由Aspergillus flavus引起的儲(chǔ)藏期花生黃曲霉素的污染[46]。Tracz等采用AITC對(duì)儲(chǔ)藏期玉米粒密閉熏蒸處理48 h后進(jìn)行通風(fēng)處理，檢測(cè)了玉米粒中AITC的殘留量。結(jié)果表明，通風(fēng)24 h后，玉米籽粒中可檢測(cè)到44.5%的AITC，繼續(xù)密封保存30 d后籽粒中仍有15.5%的AITC被檢測(cè)出，說明在儲(chǔ)藏過程中，玉米?？梢宰鳛锳ITC的吸收維持載體，通過緩釋的方式逐漸散發(fā)到空氣中，對(duì)儲(chǔ)藏期玉米由5種真菌產(chǎn)生的12種毒素都具有顯著的抑制效果[47]。Nazareth等研究表明，AITC可降低儲(chǔ)藏期面粉中由寄生曲霉Aspergillus parasiticus產(chǎn)生的黃曲霉毒素（aflatoxin）及早熟禾鐮刀菌Fusarium poae產(chǎn)生的白僵菌素（beauvericin）和恩鐮孢菌素（enniatin）的積累[48]。除此之外，也有學(xué)者采用AITC對(duì)萵苣、蘋果、番茄、草莓、黑莓、懸鉤子等蔬果儲(chǔ)藏期病害進(jìn)行防控研究[49-51]。在殺蟲方面，AITC也具有安全高效性且與磷化氫等無交互抗藥性[52]，可作為一種針對(duì)儲(chǔ)藏期害蟲防控的有效策略。

2.4 對(duì)雜草的生物活性

Ren等[53]采用AITC進(jìn)行番茄地土壤熏蒸處理，發(fā)現(xiàn)其不但可以有效殺滅土壤環(huán)境中的病原真菌、細(xì)菌及線蟲等，同時(shí)對(duì)土壤中的雜草（LC50=17.3～47.7 mg/kg）也具有很好的殺滅活性。Matteo等也發(fā)現(xiàn)，十字花科作物粗提取物對(duì)大穗看麥娘Alopecurus myosuroides具有優(yōu)異的生物活性[54]。Bangarwa等研究發(fā)現(xiàn)[55]，AITC作為除草劑控制莧科植物、馬唐的效果與甲基溴相當(dāng)。2018年申請(qǐng)的美國(guó)專利（US201801225077A1）中也表明，ITCs類特別適用于對(duì)雜草的抑制。

3 AITC殘留和安全性

3.1 AITC殘留分析方法

Tracz等[47]研究AITC防控儲(chǔ)藏期由Aspergillus parasiticus，F(xiàn)usarium tricinctum，F(xiàn).verticillioides以及Alternaria alternata引起的玉米毒素產(chǎn)生水平時(shí)，優(yōu)化了AITC在玉米粒中的殘留分析條件，包括1）樣品制備：將一定質(zhì)量的玉米粒浸泡在甲醇中，40℃水浴中振蕩30 min后再超聲處理10 min，20℃ 4 000 r/min離心5 min后收集上清液，過0.22 μm濾膜;2）檢測(cè)方法及條件：采用HPLC的方法，檢測(cè)器為安捷倫二極管陣列檢測(cè)器（LC-DAD），檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm，分離柱為Gemini C18（4.6 mm×150 mm，孔徑3 μm），流動(dòng)相為水∶乙腈（V∶V=60∶40），流速為0.8 mL/min。

吳華等[56]建立了20%AITC在幾種倉(cāng)庫貯藏品中的毛細(xì)管氣相色譜殘留分析方法。該方法以二氯甲烷為提取溶劑，采用毛細(xì)管氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定（與國(guó)標(biāo)GB29980-2013中規(guī)定的檢測(cè)器一致），發(fā)現(xiàn)辣根素在貯藏品中的消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，其半衰期為28～75 d，其降解過程主要是酶解、水解、光解。Ugolini等[57]采用固相微萃取技術(shù)，以氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定AITC在草莓果實(shí)中的殘留。

3.2 AITC安全性評(píng)價(jià)

3.2.1 對(duì)人體的安全性

1999年AITC免除了注冊(cè)化學(xué)品的注冊(cè)授權(quán)和限制，并且在日本作為一種商品化的天然抗菌劑或防腐劑添加到食品中[58];2006年美國(guó)規(guī)定AITC可作為一種“公認(rèn)安全食品”添加到食品儲(chǔ)藏罐中，用來延長(zhǎng)食品保質(zhì)期和抗腐敗;2011年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定AITC可作為一種食品添加劑直接加入食品中使用，而且被認(rèn)為有利于人體健康[1，46];歐洲國(guó)家也明確了AITC作為食品防腐劑和食品添加劑具有安全性[59]。

Otoni等采用AITC防控由Aspergillus flavus引起的儲(chǔ)藏期花生黃曲霉素的污染，在前15 d約92.4%的AITC已經(jīng)降解，30 d后無AITC可檢出[46]。Ugolini采用0.1 mg/L AITC處理草莓果實(shí)4 h后，可使灰霉病發(fā)生降低47.4%～91.5%，且對(duì)果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等無影響，儲(chǔ)藏7 d后AITC殘留量低于1 mg/kg[57]。Santos等采用300 μL/kg的AITC對(duì)儲(chǔ)藏期密封保存的玉米粒真菌毒素的產(chǎn)生進(jìn)行防控，結(jié)果表明，儲(chǔ)藏150 d后，AITC對(duì)玉米種子的發(fā)芽勢(shì)、含水量、容重以及電導(dǎo)率等生理指標(biāo)均無影響[60]。Wu等[25]采用AITC處理稻米，其殘留量低于5 μg/g。歐盟委員會(huì)規(guī)定，AITC日攝取量（tolerable daily intake， TDI）最高為每千克體重0.06 mg[61]。研究表明，一定時(shí)間后AITC殘留基本檢測(cè)不到或含量極低，表明采用AITC進(jìn)行食品保鮮或病害防控，不太可能導(dǎo)致儲(chǔ)藏產(chǎn)品中的殘留問題，也不太可能會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅。美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（United States Environmental Protection Agency）官方數(shù)據(jù)表明，AITC安全性高，對(duì)嬰幼兒等也無不良反應(yīng)（https：∥www.epa.gov/）。

3.2.2 對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性

Zaborski等采用100 mg/L的AITC作驅(qū)避劑收集土壤中的蚯蚓，其收集效果與200 mg/L的福爾馬林相比無顯著差異，且對(duì)蚯蚓具有更小的毒性，因此認(rèn)為將AITC引入土壤環(huán)境中是安全的[62]。Borek等[63]測(cè)定了AITC在6種不同土壤中的半衰期，為20～60 h，且隨著土壤水分的降低和溫度的升高，AITC降解速度加快。Isagro美國(guó)公司聯(lián)合美國(guó)多所大學(xué)的研究人員針對(duì)以AITC為原料登記的土壤熏蒸劑“DOMINUS”進(jìn)行了嚴(yán)格的測(cè)試，說明其在土壤中能快速降解，在作物種植前施用，土壤中不會(huì)殘留，是一款環(huán)境友好型的產(chǎn)品[64]。Wu等認(rèn)為AITC對(duì)非靶標(biāo)生物具有極低的毒性，因此也易被農(nóng)戶接受[65]。

研究報(bào)道[36，66]表明，土壤中的有益微生物如Trichoderma spp.等對(duì)AITC不敏感，展現(xiàn)出很強(qiáng)的忍耐性。Weerakoon等也發(fā)現(xiàn)AITC處理過的土壤環(huán)境中，T.hamatum和T.virens仍然是主要群體[34]。美國(guó)EPA官方數(shù)據(jù)表明AITC對(duì)環(huán)境友好，對(duì)非靶標(biāo)生物（除部分昆蟲如蜜蜂外）無毒性作用[67]。

4 AITC的農(nóng)藥登記與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

4.1 AITC劑型研發(fā)

由于AITC分子量很小，化學(xué)性質(zhì)活潑，常溫下具有很強(qiáng)的揮發(fā)性和刺激性，給使用帶來了不便。彭家華采用分子包結(jié)絡(luò)合法，制備了AITC微膠囊劑。該微膠囊劑有一定的緩釋作用且利用率可提高到80%左右[68]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李健強(qiáng)團(tuán)隊(duì)選用高吸附性惰性材料等載體和助劑制備了多種用途的AITC劑型：包括水乳劑，顆粒劑，緩釋型顆粒劑，緩釋型紙片、塑料、塊、袋等。

4.2 AITC施藥器械及方式

辣根素是新型植物源藥劑，作為土壤處理劑可有效殺滅多種土壤微生物，防控多種土傳病害。施藥時(shí)可根據(jù)土傳病害發(fā)生嚴(yán)重程度選擇隨水滴灌施用或在播種前或移栽前采用起壟覆膜密封后，進(jìn)行土壤熏蒸。

常用施藥器械有煙霧施藥機(jī)、遠(yuǎn)程機(jī)動(dòng)噴霧器等高效施藥器。目前，由北京市果類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)病蟲防控研究室聯(lián)合設(shè)施設(shè)備研究室研發(fā)的辣根素土壤消毒專用施藥機(jī)械已面世，該設(shè)備基本具備液態(tài)藥劑土壤注射施用功能，機(jī)具采用履帶式行走，穩(wěn)定性高;可根據(jù)行走速度精準(zhǔn)設(shè)定施藥量;可根據(jù)消毒需要調(diào)節(jié)施藥深度;采用多重防堵防漏措施，具有很高的施藥安全性（http：∥www.bjny.gov.cn/）。當(dāng)然，由于AITC具有強(qiáng)烈的刺激性，進(jìn)行消毒時(shí)，操作人員應(yīng)該進(jìn)行自身防護(hù)，如佩戴護(hù)目鏡、防毒面具等。

4.3 AITC的農(nóng)藥登記

以AITC為原料進(jìn)行的農(nóng)藥登記，最早是美國(guó)約旦農(nóng)業(yè)公司2000年登記的“Dazitol”。它是一種由辣椒素及相關(guān)物質(zhì)（有效含量為0.42%）和異硫氰酸烯丙酯（有效含量為3.7%）組成的混合物，用于土壤處理可有效殺滅或抑制土壤中的線蟲、有害昆蟲、病原菌及雜草[69]。目前Dazitol正式登記的國(guó)家或地區(qū)有智利、約旦、阿聯(lián)酋、科威特、美國(guó)、希臘、土耳其、摩洛哥、黎巴嫩、以色列、墨西哥、哥倫比亞、巴西、阿根廷、泰國(guó)、秘魯、埃及、西班牙、伊拉克等（http：∥www.ynlagensu.com/userlist/lclmsw/text-9449.html）。除此之外，Isagro美國(guó)公司2014年登記的以AITC為活性成分的“Dominus”產(chǎn)品（https：∥www.isagro.com/prodotti/fumiganti.html）是第一款可同時(shí)用于傳統(tǒng)及有機(jī)耕種的土壤生物熏蒸劑，對(duì)土壤中的真菌、線蟲、雜草和昆蟲具有廣譜防治功效，其登記類別為“以天然物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物農(nóng)藥”[65]。2017年，Mardel Rose Belotinsky TriCal公司登記了AITC與氯化苦的復(fù)配制劑投入市場(chǎng)（http：∥www.trical.com/）。

2018年，以AITC為有效成分的我國(guó)自創(chuàng)品牌“70%辣根素原藥”（登記證號(hào)：PD20181601）和“20%辣根素水乳劑”（登記證號(hào)：PD20181600）由云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司獲得首家農(nóng)藥登記，用于防治番茄根結(jié)線蟲。

4.4 AITC替代溴甲烷的應(yīng)用

溴甲烷作為一種熏蒸類殺蟲劑由來已久[70]。1932年法國(guó)首先使用，1937年后廣泛使用于植物檢疫熏蒸處理，我國(guó)于1953年開始用于熏蒸棉籽，后逐漸用于陸地或船艙中的熏蒸滅蟲及倉(cāng)儲(chǔ)期殺蟲[71]。根據(jù)《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案，發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家分別于2005年和2015年淘汰使用溴甲烷。為了淘汰溴甲烷，各國(guó)科學(xué)家都在努力尋找安全、經(jīng)濟(jì)、有效的替代品，并取得了一些進(jìn)展，如磷化氫、威百畝、氯化苦等[56]。但隨著用藥歷史的延長(zhǎng)，多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)了包括玉米象、谷蠹、赤擬谷盜、嗜蟲書虱等在內(nèi)的至少11種儲(chǔ)藏物害蟲表現(xiàn)出對(duì)磷化氫，溴甲烷等的抗性[72-75]，因此，尋找新型的安全、高效、可替代溴甲烷和磷化氫的新型化學(xué)品迫在眉睫。

曹坳程等[69，78]早在2006年提出AITC是一種安全、環(huán)境相容性好的熏蒸劑，是溴甲烷的潛在替代品。近年來，國(guó)內(nèi)越來越多的團(tuán)隊(duì)通過大量的田間實(shí)踐，證明AITC具有廣闊的應(yīng)用前景。

為實(shí)現(xiàn)中國(guó)政府的履約目標(biāo)，由環(huán)境保護(hù)部和農(nóng)業(yè)部共同組織實(shí)施了農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰項(xiàng)目，舉辦了“2015年農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰與土壤消毒技術(shù)培訓(xùn)班”，由北京市植保站作為執(zhí)行和技術(shù)指導(dǎo)單位，聯(lián)合中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源總站以及多個(gè)企業(yè)在山東、河北等省市開展辣根素土壤消毒試驗(yàn)，為溴甲烷替代藥劑的開發(fā)和應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，推動(dòng)溴甲烷淘汰項(xiàng)目順利實(shí)施[76]。

國(guó)內(nèi)以云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司為代表的企業(yè)，大力開展以AITC為有效成分的農(nóng)藥制劑開發(fā)，在馬鈴薯病害綜合防治、棉花黃萎病、草莓根腐病、蔬菜根結(jié)線蟲等主要作物種傳、土傳病蟲害，以及大宗蔬菜黃瓜、番茄等蔬菜多種地上部病蟲害治理中取得了良好的防控效果。目前，國(guó)內(nèi)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)以及云南農(nóng)業(yè)大學(xué)等高校也積極采用AITC防控魔芋細(xì)菌性軟腐病、具有連作障礙的三七根腐病以及食用百合根及鱗莖腐爛病[77]等，取得了階段性進(jìn)展。

5 AITC的作用機(jī)制

吳華等對(duì)AITC在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域抗腫瘤、抗癌的活性，以及其對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)害蟲、病原微生物、線蟲、雜草等農(nóng)業(yè)有害生物的活性研究進(jìn)行了綜述[79]。本文結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道重點(diǎn)對(duì)AITC的作用機(jī)制進(jìn)行評(píng)述。

5.1 誘導(dǎo)線蟲細(xì)胞壓力

Saini等用AITC處理秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans，采用RT-qPCR方法研究了AITC對(duì)其熱激蛋白基因HSP70表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度AITC（<0.1 μmol/L）處理對(duì)HSP70的表達(dá)無影響，而高濃度（>0.1 μmol/L）處理，HSP70的表達(dá)會(huì)增加4～5倍，表明AITC可以誘導(dǎo)線蟲細(xì)胞壓力，進(jìn)而起到毒力效果[80]。

5.2 對(duì)昆蟲的毒力機(jī)制

Wu等采用AITC熏蒸處理玉米象，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，線粒體基質(zhì)變得稀疏且空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重。進(jìn)一步作者又研究了AITC對(duì)玉米象中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶和乙酰膽堿酯酶的活性，結(jié)果表明，4種酶的活性均與AITC的處理時(shí)間和劑量有關(guān)，即低劑量呈現(xiàn)活性增強(qiáng)，高劑量呈現(xiàn)活性抑制。作者推測(cè)，線粒體可能是AITC的作用位點(diǎn)之一且細(xì)胞色素C氧化酶可能是AITC的作用靶標(biāo)蛋白[81];進(jìn)一步研究表明，AITC對(duì)線粒體復(fù)合物IV的抑制效果比復(fù)合物I更為明顯，預(yù)示了線粒體復(fù)合物IV可能是AITC的初級(jí)靶標(biāo)[82]。同時(shí)，通過克隆玉米象中細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ，并純化該蛋白，進(jìn)一步分析了AITC對(duì)該酶的活性，采用同源建模（homology modeling）以及分子對(duì)接（molecular docking）分析認(rèn)為，AITC中的硫原子可以與細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅱ上的一個(gè)亮氨酸殘基結(jié)合[83]。進(jìn)一步結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AITC熏蒸處理玉米象后，玉米象117個(gè)基因出現(xiàn)過表達(dá)，271個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。KEGG富集分析表明，大多數(shù)基因富集集中在“折疊、分類和降解”、“運(yùn)輸和分解代謝”、“能量代謝”和“碳水化合物代謝”。提出了細(xì)胞骨架丟失和線粒體功能障礙是AITC對(duì)玉米象的致死機(jī)制[84]。

5.3 抑制植物病原菌的相關(guān)機(jī)制

已報(bào)道AITC具有抗癌活性，胞內(nèi)靶標(biāo)涉及多種，如細(xì)胞色素P-450（CYP450）、抗氧化過程、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)的蛋白[85]。

Bailey等報(bào)道了甘藍(lán)中ITCs類物質(zhì)自然水解產(chǎn)物，包括硫化氫、二硫化碳以及其他胺化成分，發(fā)現(xiàn)部分水解產(chǎn)物同樣具有抑菌活性[86];Tang等也描述了微生物對(duì)ITCs類物質(zhì)的降解，認(rèn)為芐胺（benzylamine）為主要產(chǎn)物[87]。Kawakishi等認(rèn)為，ITCs可通過破壞蛋白之間的二硫鍵，影響細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[88];Kojima等對(duì)多種ITC物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其均可顯著性抑制酵母的細(xì)胞色素C氧化酶的活性，影響酵母細(xì)胞的代謝功能[89]，但與典型的呼吸抑制劑如KCN與抗霉素A相比，AITC對(duì)待測(cè)酵母的MIC濃度卻低了100倍左右，說明AITC并不是一種強(qiáng)烈的呼吸抑制劑，也說明抑制氧攝取并不是AITC的主要抑菌機(jī)制[90];Lim等發(fā)現(xiàn)，ITCs類物質(zhì)也可影響β-半乳糖苷酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞代謝物泄露，抑制革蘭氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng)[91]。Delaquis等則認(rèn)為，ITCs類物質(zhì)可能是發(fā)揮了氧化磷酸化解偶聯(lián)劑的作用，因?yàn)閷?duì)于嚴(yán)格好氧的真菌而言，其對(duì)ITCs類物質(zhì)具有更高的敏感性[5]。ITCs完整的作用機(jī)制至今仍然不清楚[92]，以往的文獻(xiàn)中也并沒有揭示單一的作用位點(diǎn)，因此，其作用機(jī)制通常被認(rèn)為是作為一種非特異性的抑制劑。

Isshiki等研究了AITC對(duì)多種細(xì)菌的抑制效果。結(jié)果表明，相比革蘭氏陽性菌，陰性細(xì)菌對(duì)AITC的敏感性更高[93]。Lin等發(fā)現(xiàn)，處于指數(shù)期細(xì)菌比處于穩(wěn)定期細(xì)菌對(duì)AITC敏感性更高;同時(shí)，通過比較青霉素、鏈霉素、多黏菌素B以及AITC，認(rèn)為AITC的作用機(jī)制與多黏菌素B更為接近，因?yàn)槎囵ぞ谺具有一個(gè)親水性七肽環(huán)和一個(gè)疏水鏈，使其具有兩性分子的屬性，而AITC同樣具有兩性分子屬性，即含有一個(gè)極性的末端和一個(gè)非極性末端鏈，這使得AITC可以更容易改變胞膜通透性[10， 90， 94]。

AITC對(duì)害蟲的作用機(jī)制尚未完全建立[25]，也有很多假說提出，一些人認(rèn)為AITC可以與含硫基團(tuán)、二硫鍵、蛋白質(zhì)的氨基酸、氨基酸殘基發(fā)生非特異性以及不可逆的結(jié)合。Murata等[95]認(rèn)為AITC還可誘導(dǎo)DNA損傷。

王彥檸[96]通過掃描電鏡觀測(cè)菌絲表面形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AITC熏蒸處理的供試菌菌絲出現(xiàn)不同程度的皺縮、畸形、瘤狀突起及內(nèi)容物外滲等現(xiàn)象，透射電鏡可觀測(cè)到菌絲外壁及膜結(jié)構(gòu)破裂受損，細(xì)胞壁不規(guī)則增厚或消解，甚至出現(xiàn)細(xì)胞壁剝落;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AITC可增加細(xì)胞膜通透性，對(duì)供試真菌具有低濃度促進(jìn)呼吸高濃度抑制呼吸的雙重作用，且隨著藥劑處理濃度的增加，供試靶標(biāo)菌菌絲中ATP含量及能荷值均降低。

5.4 AITC誘導(dǎo)植物抗性機(jī)制

研究表明，AITC對(duì)于植物生長(zhǎng)和存活是一種重要的防衛(wèi)成分[97]。Sporsheim等研究發(fā)現(xiàn)[98]，AITC通過可逆地抑制高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和液泡中依賴肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。Khokon等研究報(bào)道，AITC可以誘導(dǎo)蠶豆、擬南芥氣孔關(guān)閉，從而保護(hù)自身避免水分喪失或潛在病原菌的侵染[99-100]。Wang等[101]研究表明，AITC可以增強(qiáng)藍(lán)莓果實(shí)H2O2的產(chǎn)生和自由基形成，從而對(duì)病原菌產(chǎn)生高強(qiáng)度的氧化壓力，提高藍(lán)莓對(duì)病原菌的抵抗作用。除此之外，ITCs類物質(zhì)作為化感物質(zhì)、硫儲(chǔ)存物質(zhì)，以及在耐熱、細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)抑制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮重要作用。Calmes等以Alternaria brassicicola作為模式菌株，研究了其與十字花科蔬菜大白菜的互作過程。結(jié)果表明，植物體內(nèi)的GSLs降解產(chǎn)物（即ITCs類物質(zhì)）可誘導(dǎo)A.brassicicola胞內(nèi)氧消耗降低、活性氧ROS積累下降，線粒體膜電位下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，A.brassicicola中一個(gè)涉及MAP激酶基因（AbHog1）和一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（AbAP1）參與了植物與病原菌的互作過程[102-103]。

6 展望

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)集約化程度不斷提高，特別是設(shè)施農(nóng)業(yè)快速發(fā)展，導(dǎo)致土傳病蟲害的問題日益突出;同時(shí)，農(nóng)藥化肥等的不合理使用也對(duì)空氣、土壤和水體等造成了嚴(yán)重的面源污染。甲基溴是國(guó)際上公認(rèn)的土壤熏蒸效果最好的藥劑[77]，但由于其具有破壞臭氧層作用，聯(lián)合國(guó)已將其禁用。2016年由科技部首次啟動(dòng)“化學(xué)肥料和農(nóng)藥減施增效綜合技術(shù)研發(fā)”項(xiàng)目，提出“優(yōu)先選用生物農(nóng)藥或高效低毒低殘留化學(xué)農(nóng)藥”。AITC作為一種廣譜、高效、安全的生物熏蒸劑，各國(guó)學(xué)者對(duì)其生物活性的研究已較為寬廣，這充分表明辣根素是極具應(yīng)用潛力的一類化合物。

6.1 拓展AITC研究，為作物綠色防控提供新舉措

AITC是一類國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注和重視研究開發(fā)的藥劑，可以滿足和適應(yīng)于保護(hù)地或覆膜栽培、倉(cāng)儲(chǔ)期病蟲害的防控等方面。推動(dòng)植物病蟲害的源頭控制，播種或移栽前通過土壤熏蒸處理，可從源頭降低田間初始病蟲數(shù)量，有效降低病蟲害的發(fā)生危害;生長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)棚室進(jìn)行熏蒸消毒，還可以有效降低蔬菜霜霉病、白粉病等多種氣傳病害和煙粉虱、薊馬等小型害蟲的為害。一藥多靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)作物生長(zhǎng)不同階段病蟲害的預(yù)防和治理。同時(shí)，因其為植物源農(nóng)藥，具有環(huán)境友好特征，可使其對(duì)環(huán)境造成污染的程度降至最低。

6.2 推動(dòng)AITC產(chǎn)業(yè)化，為國(guó)家甲基溴替代提供新路徑

國(guó)家甲基溴替代過程并非一蹴而就。自2003年批準(zhǔn)《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案以來，中國(guó)就一直致力于甲基溴的替代工作。2008年起，農(nóng)業(yè)部、環(huán)境保護(hù)部和聯(lián)合國(guó)工業(yè)發(fā)展組織共同啟動(dòng)了農(nóng)業(yè)甲基溴淘汰項(xiàng)目，農(nóng)業(yè)部科技教育司作為具體實(shí)施單位，專設(shè)農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰項(xiàng)目辦公室，協(xié)調(diào)各地方政府、科研單位、企事業(yè)單位、農(nóng)戶等開啟了長(zhǎng)達(dá)10年的履約征程，最終篩選出了對(duì)靶標(biāo)菌滅菌活性高、對(duì)食品安全及對(duì)非靶標(biāo)微生物干擾小的替代熏蒸劑，辣根素便名列其中?；跓o殘留的綠色土壤配套處理措施，很好地解決了多種作物土傳病蟲害的危害，農(nóng)業(yè)部于2011年宣布撤銷甲基溴在草莓、番茄、黃瓜等作物上的登記。隨著生姜產(chǎn)業(yè)的異軍突起，土傳病害造成的問題凸顯。氯化苦作為唯一登記的替代品，無法有效控制根結(jié)線蟲。為避免對(duì)行業(yè)的沖擊，2014年中國(guó)又向聯(lián)合國(guó)臭氧保護(hù)秘書處提出申請(qǐng)，為部分生姜產(chǎn)區(qū)甲基溴防控根結(jié)線蟲爭(zhēng)取到一定的豁免權(quán)。國(guó)家項(xiàng)目辦綜合考慮履約形式及國(guó)家對(duì)高毒農(nóng)藥逐步淘汰戰(zhàn)略，最終承諾2019年1月1日起全面禁止甲基溴在農(nóng)業(yè)上的使用。2018年我國(guó)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)AITC為有效成分的自創(chuàng)品牌“70%辣根素原藥”（登記證號(hào)：PD20181601）和“20%辣根素水乳劑”（登記證號(hào)：PD20181600）首家登記，有望為我國(guó)甲基溴替代提供新的路徑。

6.3 強(qiáng)化AITC應(yīng)用培訓(xùn)，打通技術(shù)推廣“最后一公里”

辣根素作為一種新型土壤消毒劑，因其強(qiáng)烈的揮發(fā)刺激性，加之農(nóng)戶對(duì)土壤消毒的認(rèn)知水平整體偏低，導(dǎo)致其在推廣應(yīng)用中面臨一定的挑戰(zhàn)。因此，應(yīng)不斷加強(qiáng)對(duì)其劑型、施藥器械等的研究開發(fā)以及對(duì)田間應(yīng)用效果、安全性等的評(píng)價(jià)研究，同時(shí)做好宣傳普及推廣;倡議創(chuàng)設(shè)全國(guó)辣根素應(yīng)用技術(shù)合作聯(lián)盟，加大投入力度，增強(qiáng)與地方農(nóng)技服務(wù)中心、植保站等的合作，形成系統(tǒng)，通過開設(shè)辣根素應(yīng)用技術(shù)培訓(xùn)班，不斷強(qiáng)化管理人員、生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)銷商及農(nóng)戶等的認(rèn)知水平。通過試驗(yàn)示范和田間現(xiàn)場(chǎng)反饋，不斷完善和制定辣根素的使用技術(shù)規(guī)程;不斷加強(qiáng)農(nóng)戶對(duì)土壤熏蒸的認(rèn)知，嚴(yán)格按照使用技術(shù)規(guī)程操作，確保農(nóng)事操作人員和作物生產(chǎn)安全。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）