王惠君， 孫 妍， 王文泉， 范慶君， 王仕明， 謝詩宏

(1.海南農(nóng)墾南繁種業(yè)有限公司，海南三亞 572000； 2.海南熱帶海洋學院，海南三亞 572022； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101)

目前，對海洋生物遺傳育種工作[1]的研究剛剛起步，其研究的深度遠落后于陸地生物[2]的研究。雖然近20年來海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，但其種類的選擇僅僅停留在少數(shù)幾種經(jīng)濟型海洋生物上[3-4]，養(yǎng)殖方法也處于野生或半野生的狀態(tài)，這嚴重制約了海洋生物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展?？焖儆行У赝诰蚝Ｑ笊镔Y源的潛力，對經(jīng)濟型海洋生物優(yōu)勢種的選育工作意義重大，研究內(nèi)容具體包括合適生長周期的選育種、生長快肉質(zhì)好的選育種、抗逆性強的選育種、藥用型生物的選育種等。

遺傳和變異作為生物的重要特征，決定著海洋生物的進化。遺傳標記是研究海洋生物遺傳和變異的基本手段和方法。作為能穩(wěn)定遺傳、表達海洋生物變異性的這類可以被檢測形狀或物質(zhì)的遺傳標記，前后主要經(jīng)歷了形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記、DNA分子標記等4個發(fā)展階段。作為理想的標記有如下特性：標記遍布整個基因組并在整個基因組中的分布要均勻，多態(tài)性較高，共顯性遺傳，受外界環(huán)境影響較小，檢測簡單、快速、重復性好、成本低廉等。在具體的試驗過程中現(xiàn)有遺傳標記技術(shù)要想達到理想狀態(tài)仍須改進。DNA分子標記技術(shù)與形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記相比具有多態(tài)性較高、標記數(shù)量多、不受發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用在DNA指紋圖譜的構(gòu)建、生物遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、生物進化、基因定位、基因克隆、基因組遺傳圖譜的構(gòu)建、標記輔助選擇等方面。筆者依據(jù)對海洋生物基因組信息量掌握的多少，分別主要介紹分子標記的原理、優(yōu)缺點及應(yīng)用范圍，以期為海洋生物遺傳育種的相關(guān)研究工作提供有價值的參考。

1 海洋生物基因組信息未知的情況下對分子標記技術(shù)方法的選擇

在海洋生物基因組未知的情況下，應(yīng)用標記技術(shù)對基因組進行探索，從難易程度和效率上綜合考慮選擇如下：擴增子長度多態(tài)性(amplicon length polymorphism，簡稱ALP)、內(nèi)部簡單重復序列(inter simple sequence repeats，簡稱ISSR)、相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)、多樣性芯片技術(shù)( diversity arrays technology，簡稱DArT)。

1.1 擴增子長度多態(tài)性

ALP是以隨機引物PCR技術(shù)擴增為基礎(chǔ)的一類標記合稱，它主要包括的分子標記有DNA擴增指紋印記(DNA amplified figerpriting，簡稱DAF)、隨機引物PCR擴增(arbitrarily primed polymerase chain reaction，簡稱AP-PCR)、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)。其中，AP-PCR技術(shù)[5]和RAPD技術(shù)[6]是由Welsh等于1990年提出的，DAF是一種改進的RAPD分析技術(shù)。三者都是利用PCR技術(shù)為基礎(chǔ)來檢測DNA多態(tài)性的方法?；驹恚篋AF使用的是高濃度短引物(5～8 bp)、RAPD使用隨機短引物(8～10 bp)、AP-PCR使用的引物長度范圍為 10～50 bp，通過PCR擴增反應(yīng)得到非定點擴增DNA片段，只要基因組在擴增區(qū)域內(nèi)DNA片段上發(fā)生堿基突變、缺失或插入就有可能導致該區(qū)域結(jié)合位點的分布發(fā)生改變，擴增出的DNA片段大小和數(shù)量隨即會發(fā)生變化。利用凝膠電泳分析該DNA片段，然后用銀染法進行顯色讀帶，將使擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)不同或相同的多態(tài)性DNA片段。該技術(shù)的優(yōu)點是技術(shù)簡單且成本低、DNA用量少、對基因組檢測速度快、具有通用性。該技術(shù)的缺點是不能鑒別純合子和雜合子、穩(wěn)定性和重復性較差。其中，DAF技術(shù)使用高濃度的短引物進行PCR擴增，擴增出的DNA片段在凝膠上分離后通過銀染染色形成的譜帶過于復雜。由于ALP技術(shù)簡單、容易操作、可高效探索未知基因組多態(tài)性檢測等特性，使該技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。在海洋生物研究中，RAPD技術(shù)可以應(yīng)用在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、功能基因的探索等領(lǐng)域[7-8]，RAPD技術(shù)與構(gòu)建DNA混合近等基因池分離分析方法(bulked segregant analysis，簡稱BSA)相結(jié)合更有利于基因定位、遺傳圖譜的飽和分析等研究。AP-PCR和DAF技術(shù)則分別用于基因組指紋分析、遺傳圖譜的構(gòu)建。ALP技術(shù)主要應(yīng)用在大黃魚、馬氏珠母貝、翡翠貽貝、櫛孔扇貝、青蛤、文蛤、泥蚶等海洋生物物種上。

1.2 內(nèi)部簡單重復序列

內(nèi)部簡單重復序列又稱為錨定簡單重復序列(anchored simple sequence reapeats，簡稱ASSR)，該標記是依據(jù)真核生物中SSR的分布較為普遍，且進化速度較快的特性，檢測出基因組中較多的多態(tài)性位點。ISSR標記利用常出現(xiàn)的SSR本身作為錨定引物(在SSR序列的3′端或5′端加入2～4個隨機堿基)，再配1個隨機引物進行組合之后進行擴增，因具有無須克隆和測序的特性。該技術(shù)的優(yōu)點為DNA用量較少、成本低、技術(shù)門檻不高、穩(wěn)定性和重復性較好，多態(tài)性表現(xiàn)為中等。該技術(shù)的缺點為有些物種的ISSR標記可能較少，不能推廣到所有物種。該技術(shù)可以應(yīng)用在對海洋生物的生物遺傳多樣性分析[9-12]等研究中。

1.3 序列相關(guān)擴增多態(tài)性

SRAP又稱為基于序列擴增多態(tài)性(sequence based amplified polymorphism，簡稱SBAP)，由美國加州大學Li等提出，其原理是依據(jù)基因外顯子中鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量豐富而內(nèi)含子、啟動子中腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)含量豐富的特點設(shè)計2套不同的引物進行擴增[13]。在基因組中主要檢測對象為開放讀碼框(open reading frame，簡稱ORF)區(qū)域。該技術(shù)的優(yōu)點為成本低、技術(shù)簡單、試驗穩(wěn)定、多態(tài)性中等。該技術(shù)的缺點為該標記的設(shè)計在對著絲粒和端粒附近基因組區(qū)域?qū)儆诿^(qū)，且并非對所有生物具有通用性，仍須針對不同的生物進行開發(fā)。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在對物種質(zhì)資源多態(tài)性評價[14]、遺傳圖譜的構(gòu)建以及基因定位等方面。

1.4 擴增片段長度多態(tài)性

AFLP又被稱為選擇性限制片段擴增(selective restrictive fragment amplification，簡稱SRFA)，是由荷蘭科學家Zabeau等發(fā)現(xiàn)一種分析基因組DNA多態(tài)性的方法[15]。它以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合擴增片段的多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)和RAPD 2種技術(shù)的優(yōu)點。首先用1對限制性內(nèi)切酶把基因組DNA進行雙酶切，接著對酶切片段的兩端用連接酶增加上帶有特定堿基序列的“接頭”，然后用選擇性引物對酶切片段進行PCR特異擴增，通過聚丙烯酰胺測序膠進行電泳，將特異的DNA擴增產(chǎn)物片段分離開，然后用熒光法、放射性法、銀染法等進行檢測，最后用生物分析軟件對DNA譜帶進行分析。該技術(shù)發(fā)展較快，同時有些學者在研究過程中根據(jù)試驗的內(nèi)容進行了改進。在原有雙酶切法基礎(chǔ)上增加了單限制性內(nèi)切酶選擇擴增片段技術(shù)和三限制性內(nèi)切酶選擇擴增性擴增片段技術(shù)，借助以上2種方法對AFLP技術(shù)進行了完善。該技術(shù)的優(yōu)點集RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點于一身，具有高通用性、高多態(tài)性、高穩(wěn)定性、高分辨率、高效性等特點。該技術(shù)的缺點為所需樣品DNA質(zhì)量高、試驗成本較高、步驟復雜且操作要求嚴格等。AFLP技術(shù)應(yīng)用到海洋生物的種類包括鮸魚、金鯛、大黃魚、石斑魚、斑馬魚、舌齒鱸、紫菜、翅藻等，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用在生物遺傳多樣性分析基因的表達與調(diào)控研究[16-19]、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和種質(zhì)鑒定等研究領(lǐng)域。

1.5 多樣性芯片技術(shù)

2001年，Jaccoud等在酶切連接技術(shù)、芯片雜交技術(shù)等基礎(chǔ)上研發(fā)了一項辨別不同基因組之間多態(tài)性的方法，即多樣性芯片技術(shù)[20]。該方法對不同樣本的基因組DNA等量混合并進行限制性內(nèi)切酶消化后，及時將酶切片段與接頭連接，隨后用與接頭對應(yīng)的特異性引物對該基因組進行PCR擴增，得到該基因組的代表性片段。將該片段用不同的熒光進行標記后作為探針再與芯片進行雜交。利用掃描儀檢測雜交信號的有無或強弱來確定待檢測樣本的遺傳差別，這些差別的標記就是DArT標記。該技術(shù)的優(yōu)點為試驗重復性好、信息穩(wěn)定可靠、高通量信息可實現(xiàn)自動化分析、可用于沒有序列信息的任何海洋類物種、新的標記發(fā)現(xiàn)和標記評價都是在同一芯片上同時進行的、不易受發(fā)育階段時空表達的影響。該技術(shù)的缺點為試驗成本較高、不適合普通實驗室、標記為顯性、不能區(qū)分純/雜合型。該技術(shù)可以應(yīng)用于遺傳分類及進化的分析[21]、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、輔助育種[22]等研究領(lǐng)域。

2 掌握較少海洋生物基因組信息情況下分子標記技術(shù)方法的選擇

在已知較少海洋生物基因組信息的情況下，用標記技術(shù)方法對基因組進行探索，從難易程度和效率上綜合考慮選擇排序如下：(1)以重復序列為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，包含簡單序列重復(simple sequence repeat，簡稱SSR)、數(shù)目串聯(lián)重復多態(tài)性(variable number of tandem repeat，簡稱VNTR)、單引物擴增反應(yīng)(single primer amplification reaction，簡稱SPAR)、小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴增(directed amplification of minisatellite region，簡稱DAMD)等；(2)序列特征化擴增區(qū)域(sequence characterized amplified region，簡稱SCAR)；(3)靶位區(qū)域擴增多態(tài)性(target region amplified polymorphism，簡稱TRAP)；(4)以mRNA為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，包含表達序列標簽(expressed seque tags，簡稱ESTs)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR)、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(different display reverse transcript PCR，簡稱DDRT-PCR)、特征性差異分析(representive difference analysis，簡稱RAD)；(5)序列標簽位點(sequence tagged site，簡稱STS)；(6)線粒體DNA(mitochondrial DNA，簡稱mtDNA)標記；(7)擴增的片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)；(8)染色體原位雜交(chromosome in situ hybridization，簡稱CISH)。

2.1 以重復序列為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)

該系列的分子標記技術(shù)包括SSR、VNTR、SPAR、DAMD等。其主要依據(jù)為在真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2～5 bp或10～1 000 bp不等的重復序列，稱之為衛(wèi)星。2～5 bp較短串聯(lián)重復序列稱之為微衛(wèi)星，其中(CA)n重復序列較為普遍。SSR[又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)]和VNTR[又稱小衛(wèi)星DNA(mini satellite DNA)]的引物是依據(jù)重復序列兩翼特異保守序列進行設(shè)計的，擴增出片段的多態(tài)性即為衛(wèi)星的多態(tài)性。SPAR技術(shù)又稱為微衛(wèi)星引物聚合酶鏈式反應(yīng)(microsatellite-primed PCR，簡稱MP-PCR)，與RAPD相類似，常用1個引物，在SPAR分子標記技術(shù)中不同的是所用引物不是隨機的而是在SSR標記基礎(chǔ)上開發(fā)設(shè)計的，擴增出的片段是SSR之間的DNA序列。DAMD標記技術(shù)直接以小衛(wèi)星的核心序列為引物對基因組進行多態(tài)性擴增。該類標記的優(yōu)點為試驗技術(shù)成熟且易操作、檢測穩(wěn)定且快速、信息量較大、分辨率較高、多態(tài)性中、為顯性標記。但也存在缺點，前期研發(fā)的成本高，每個物種須要針對性開發(fā)引物因而不具有通用性。在科學研究中通常以SSR標記作為首選。該類標記已成為種群研究和生物進化領(lǐng)域首選的分子標記之一，廣泛應(yīng)用于種群生物遺傳多樣性分析[23]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、生物雜交育種分析和系統(tǒng)發(fā)生等領(lǐng)域。

2.2 序列特征化擴增區(qū)域

SCAR技術(shù)是在綜合了RAPD和SSR優(yōu)點的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。為了提高RAPD標記的穩(wěn)定性，對基因組DNA分析之后再對目標RAPD片段進行克隆分析，在該片段末端采取類似SSR引物兩翼序列進行測序，設(shè)計特定引物，最后再對基因組DNA進行PCR特異性擴增，這樣使得該片段與原RAPD片段相比穩(wěn)定性和專一性更強。該標記的優(yōu)點為穩(wěn)定性好、為共顯性遺傳；該標的記缺點是操作相對復雜、須要測序、成本比ISSR和SRAP標記略高。該標記可應(yīng)用于基因定位和作圖[24]等研究領(lǐng)域。

2.3 以mRNA為基礎(chǔ)的分子標記

該系列的分子標記技術(shù)主要包括EST、RT-PCR、DDRT-PCR、cDNA-AFLP、cDNA-RFLP等。該類分子標記都是在構(gòu)建cDNA文庫基礎(chǔ)上進行研究的，其中表達序列標簽(expressed seque tags，簡稱EST)是從cDNA文庫中隨機挑選克隆，然后對該序列進行測序從而獲得長度為300～500 bp的短cDNA序列，以此為基礎(chǔ)開發(fā)出來的引物標記技術(shù)稱之為EST標記，EST標記分別與SSR、AFLP、RFLP、核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)等相結(jié)合開發(fā)出EST-SSR[25-26]、EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SNP[27]等標記方法。RT-PCR、DDRT-PCR、cDNA-AFLP、cDNA-RFLP等標記主要是研究mRNA基因差異表達的多態(tài)性分析。該類技術(shù)的優(yōu)點為除了cDNA-AFLP和cDNA-RFLP 2類技術(shù)外其他技術(shù)都相對簡單、操作方便，該類技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因組學研究的各個領(lǐng)域。該技術(shù)的缺點為EST測序方法存在誤差、匹配的應(yīng)用軟件存在局限性、揭示的基因信息不全、cDNA文庫的質(zhì)量要求異常嚴格、檢測到低豐度表達的基因較為困難、中豐度和高豐度表達的基因EST存在冗余性。

2.4 靶位區(qū)域擴增多態(tài)性

TRAP技術(shù)是由Hu等開發(fā)的，其原理是以EST信息庫和生物信息工具信息等數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，用目標候選基因區(qū)域的DNA片段分析其該區(qū)域的多態(tài)性[28]。該技術(shù)采用2條約 18 bp 的引物，一條是依據(jù)EST數(shù)據(jù)庫設(shè)計的固定引物，另一條是針對外顯子和內(nèi)含子的特點設(shè)計的隨機引物。該技術(shù)通過對靶位區(qū)域進行PCR特異性擴增，圍繞目標候選基因序列產(chǎn)生多態(tài)性標記。該標記的優(yōu)點為高通量、高效率、易操作。該標記的缺點為必須以EST和生物信息大數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，不能遍布整個基因組，只能針對特定的基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

2.5 序列標簽位點

序列標簽位點是通過一段特定引物序列所界定的一類能夠在生物基因組中作為“路標”使用的DNA標記的統(tǒng)稱。該標記必須滿足2個條件：序列已知、位置明確。該標記的優(yōu)點是可用于界定基因組的特異位點；該標記的缺點是可利用的數(shù)量太少。該標記作為遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標，隨著模式生物全基因組的測序開發(fā)，會發(fā)現(xiàn)更多的STS標記。除此以外還有基因組概覽序列標記(genome survey sequences，簡稱GSS)，主要來源于基因組序列。STS和GSS標記是以mRNA為基礎(chǔ)的一類分子標記的重要補充。

2.6 線粒體DNA標記

線粒體DNA在細胞基因組中具有相對獨立性?；蚪MDNA可以通過母性遺傳，它不僅結(jié)構(gòu)簡單而且具有較高的專一性。大量生物的線粒體全基因組已被測序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列和組成較為保守，利用其保守的特性開發(fā)出通用性較強的PCR反應(yīng)引物作為線粒體DNA標記。該標記的優(yōu)點為簡單快速；該標記的缺點為作為一種核外遺傳物質(zhì)的mtDNA反映出的遺傳信息較為片面。近年來，mtDNA技術(shù)主要應(yīng)用于進化遺傳學領(lǐng)域，該技術(shù)已成為研究真核生物發(fā)育生物學、分子遺傳學、分子系統(tǒng)進化[29]的一類重要模式體系。用該技術(shù)可檢測自然界的雜交漸滲現(xiàn)象，如海洋生物中的北美太陽魚等，還可用于追蹤特異物種的生活史，如追蹤大西洋鮭等。

2.7 擴增的片段多態(tài)性

RFLP技術(shù)是用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切，根據(jù)其所產(chǎn)生的DNA分子片段的大小反映基因組DNA由于堿基的替換、缺失、重復、插入等導致限制性酶切位點改變的現(xiàn)象。該技術(shù)需要探針DNA標記技術(shù)和Southern雜交技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點為具有廣泛適用性、全基因組檢測、等位基因為共顯性；該技術(shù)的缺點為要求DNA的質(zhì)量較高、多態(tài)性偏低、試驗操作繁瑣且因涉及放射性同位素的使用而不便、技術(shù)難度大且周期長、成本偏高。目前該技術(shù)已被應(yīng)用于基因突變分析、基因定位及診斷、親緣關(guān)系鑒定[30]、物種進化及分類關(guān)系研究等方面，尤其在組建高密度遺傳圖譜[31]方面具有重要的實用價值。

2.8 染色體原位雜交

CISH是在Southern雜交的基礎(chǔ)上利用特異性核苷酸片段為探針與細胞基因組染色體DNA片段進行雜交后直接在染色體上顯示特異DNA的方法。染色體原位雜交的優(yōu)點為精準、直觀；缺點為涉及到同位素標記或熒光標記等技術(shù)，試驗非常復雜。該技術(shù)主要應(yīng)用于物理圖譜的構(gòu)建。

3 掌握海洋生物基因組較多背景信息的情況下分子標記技術(shù)方法的選擇

在掌握海洋生物基因組較多背景信息的情況下，對分子標記技術(shù)方法存在2類選擇：一類是對海洋生物具體某等位基因多態(tài)性分析時所選的分子標記技術(shù)；另一類是對海洋生物基因組信息的多態(tài)性進行高通量分析時所選的分子標記技術(shù)。

3.1 對海洋生物某個具體等位基因分析時選用的分子標記技術(shù)

該類標記技術(shù)主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)(single- strand conformation poly-morphism，簡稱SSCP)和酶切擴增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphism sequences，簡稱CAPS)技術(shù)。2種技術(shù)的共同之處都是首先利用特定引物定點PCR擴增基因組DNA中的特異序列片段。不同之處是SSCP把擴增出的特異序列片段進行變形處理，即雙鏈分開形成2條單鏈，然后通過非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳對片段進行分離，最后染色并依據(jù)譜帶位置變化來判斷特異片段中是否存在突變；而CAPS技術(shù)是把擴增出的特異序列片段使用1種限制性內(nèi)切酶及時進行酶切，然后通過非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳對酶切片段進行分離，最后染色并依據(jù)譜帶進行RFLP分析。二者共同的優(yōu)點是操作簡單、結(jié)果可靠；其共同的缺點是只能針對基因組的某一特異序列片段進行分析。其中SSCP技術(shù)與雜交雙鏈分析(heterocluplex analysis，簡稱Het)法結(jié)合可進一步提高檢出率。該技術(shù)主要應(yīng)用于遺傳性疾病以及癌癥突變位點的檢測。而CAPS技術(shù)是PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法。CAPS技術(shù)揭示的是基因組特異性片段的限制性長度變異信息，是共顯性分子標記，可以保持RFLP分析的精確度，可以分析基因組某一特異序列片段的多態(tài)性[32]。由于可供選的限制性內(nèi)切酶較多，因此該方法檢測到多態(tài)性的機會也較大。這2項技術(shù)是檢驗SNP變異位點最簡便的方法。

3.2 高通量分析海洋生物基因組時選用的分子標記技術(shù)

該類標記技術(shù)是以mRNA轉(zhuǎn)錄本為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，其中以基因表達系列分析(serial analysis of gene expression，簡稱SAGE)作為代表；另一類是以開發(fā)核苷酸多態(tài)性的一類高通量分析技術(shù)，包括代表性寡核苷酸芯片分析(representational oligonu-cleotide microarray analysis，簡稱ROMA)、限制性內(nèi)切酶位點標簽(restriction-site associated DNA，簡稱RAD)。

3.2.1 基因表達系列分析 1995年，美國學者Velculescu等提出了SAGE分子標記技術(shù)[33]，該技術(shù)主要應(yīng)用于基因表達模式的分析。其原理是從一個轉(zhuǎn)錄本內(nèi)分離得到10～14 bp的短標簽，將多個短標簽連接并集中到一個克隆里面進行測序，以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式進行軟件運算處理，借助該模式可以對較多的mRNA轉(zhuǎn)錄本進行高通量運算分析。該標記的優(yōu)點為與EST、DDRT-PCR、RAD等技術(shù)相比具有更強的靈敏性，較容易檢測到低豐度表達的基因，可以在不須要知道基因組信息的情況下檢測出所有基因的表達情況[34]；該標記的缺點為所得到的低豐度基因表達標簽很難與網(wǎng)絡(luò)上現(xiàn)有Genbank等基因庫中的基因序列相互匹配。在該技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展出了Long SAGE、3′ Long SAGE、5′ Long SAGE等技術(shù)，其與SAGE相比提高了基因標簽的特異性，增強了標簽的匹配率。2004年Trinklein等在 SAGE 基礎(chǔ)上又研發(fā)出使用配對末端雙標簽進行基因識別特征分析(gene-identification signature analysis using paired-end ditags，簡稱GIS-PET)技術(shù)[35]，該技術(shù)不僅可獲得完整全長基因的5′ 端和3′端標簽，還可以通過PCR擴增技術(shù)得到基因全序列。該技術(shù)應(yīng)用于染色體基因注釋的同時還可以應(yīng)用于構(gòu)建基因啟動子圖譜。該技術(shù)的優(yōu)點為可定量、全面地對基因表達模式進行分析、具有較高的標簽特異性、可以擴增新基因全長序列。該技術(shù)的缺點為通量上有缺陷，只能適合于對小規(guī)模樣品基因差異表達譜的分析，其通量遠比不上其他高通量上分析的分子標記，如微陣列技術(shù)等。

3.2.2 核苷酸多態(tài)性 1996年美國學者Lander等第1次提出了SNP標記[36]，即第3代的DNA遺傳標記。SNP是指同一特異性位點的不同等位基因之間的差異，其原理是由于單堿基顛倒、轉(zhuǎn)換、缺失、插入機制導致在DNA序列上單個核苷酸的變異產(chǎn)生的DNA序列多態(tài)性。目前SNP標記已被廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的檢測[37-38]、特定功能基因或片段的分型[39-40]、種群生物學特征、基因作圖以及數(shù)量性狀定位[41-42]等研究領(lǐng)域。SNP的廣泛應(yīng)用是建立在高通量檢測技術(shù)基礎(chǔ)之上的。

3.2.2.1 代表性寡核苷酸芯片分析 2003年，Dahl等在代表性差異分析方法(representative differential analysis，簡稱RDA)的基礎(chǔ)上研發(fā)出一種芯片分析技術(shù)，該技術(shù)借助反向雜交技術(shù)，將經(jīng)過熒光標記的待測樣品與固定在玻片上的 10～70 bp寡核苷酸片斷進行雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)檢測雜交信號技術(shù)，對樣品序列信息進行分析[43]。該技術(shù)主要用于檢測基因拷貝倍數(shù)的變化以及基因差異表達分析等方面。

3.2.2.2 限制性內(nèi)切酶位點標簽 RAD是由Miller等在2007 年開發(fā)的一類高通量分子標記，其是將酶切連接技術(shù)、PCR技術(shù)和短片段海量平行測序技術(shù)相偶聯(lián)的一種高效率的分子標記技術(shù)[44]。該技術(shù)選擇不同的限制性內(nèi)切酶得到不同數(shù)量的RAD標記。該技術(shù)的優(yōu)點為作為簡化全基因組的代表在酶切位點附近進行測序可發(fā)現(xiàn)較多的SNP標記，快速、高效、成本較高。主要用于遺傳作圖[45-46]和定位突變分析[47-49]等領(lǐng)域。后來由美國康奈爾大學發(fā)展為通過測序基因分型(genotyping bysequencing，簡稱GBS)，使其具備了低成本高通量的特征，該技術(shù)研究的前提是所研究的物種已經(jīng)完成基因組測序。該技術(shù)的優(yōu)點是可以同時對大量的樣本進行測序，大大降低了測序成本；缺點是只適合于已有基因組草圖的基因組重測序。2014年中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所的夏志強等在RAD技術(shù)的基礎(chǔ)上研發(fā)出了改進重測序技術(shù)[50](amplified fragment SNP and methylation，簡稱AFSM)，即首先根據(jù)基因組的大小進行設(shè)計選擇標簽，通常在50～100個范圍內(nèi)，待測基因組DNA樣品進行混合并用雙限制性內(nèi)切酶進行酶切，并將酶切產(chǎn)物及時與選擇標簽接頭連接，然后進行PCR擴增反應(yīng)來構(gòu)建混合池；最后進行高通量測序并進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，簡稱GWAS)。GWAS通常是建立在基因組測序基礎(chǔ)上，需要有足夠覆蓋基因組的分子標記以及能對大量分子標記同時檢測的高通量技術(shù)?；蚪M學的迅速發(fā)展為種質(zhì)評價和分子育種提供了新的契機，GWAS成為發(fā)掘優(yōu)異基因資源和基因組輔助選擇育種的重要工具。

4 結(jié)束語

分子標記技術(shù)的快速發(fā)展對生物遺傳學研究領(lǐng)域的拓展起到了非常重要的作用。分子標記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于性狀標記、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆、構(gòu)建遺傳圖譜、親緣關(guān)系鑒定、物種進化及分類關(guān)系等方面。隨著低成本、高通量以及高精度基因組DNA 測序新技術(shù)的發(fā)展，分子標記技術(shù)將會展現(xiàn)更為廣闊的應(yīng)用前景。人類對海洋生物領(lǐng)域的研究遠遠落后于常規(guī)作物的研究，因此本文重點介紹了分子標記技術(shù)的選擇方法，希望能夠?qū)Ｑ笊锓N質(zhì)資源調(diào)查研究、海洋生物重要經(jīng)濟性狀基因的分子標記篩選技術(shù)、海洋生物分子輔助育種技術(shù)、海水養(yǎng)殖品種的遺傳改良技術(shù)及新品種選育研究等方面提供參考。