楊 波， 靳輝勇， 屠乃美， 田茂成， 田 峰， 周 偉， 李棟宇

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128； 2.湖南省煙草公司湘西自治州公司，湖南吉首 416000； 3.江蘇省宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇宿遷 223800； 4.湖南省煙草公司永州市公司，湖南永州 425000)

鋅是人體必需的微量元素，被稱(chēng)為“生命之花”[1]。鋅也是植物必需的微量元素之一，對(duì)于提高作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)有著重要作用[2]。然而近年來(lái)由于土地復(fù)種指數(shù)的不斷提高，氮肥的大量施用、酸性土壤過(guò)量施用石灰，導(dǎo)致土壤缺鋅的現(xiàn)象越來(lái)越普遍和嚴(yán)重[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球種植谷物的土地中有50%存在缺鋅的潛在危險(xiǎn)[5]。第2次全國(guó)土壤普查結(jié)果顯示，鋅是我國(guó)土壤第二大缺乏的養(yǎng)分元素，缺鋅土壤比例占41.97%[6]。而劉錚統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全國(guó)土壤缺鋅范圍已擴(kuò)大到61%，其中西北、華北和東北等旱作區(qū)土壤缺鋅更加嚴(yán)重，分別達(dá)到80%、70%和60%[7]。由此可見(jiàn)，施用鋅肥是平衡土壤養(yǎng)分的重要措施。

碳代謝指紋又稱(chēng)代謝特征，不同種類(lèi)微生物碳源偏好存在很大差異[8]。施用鋅肥通過(guò)平衡土壤養(yǎng)分、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性，進(jìn)而影響其代謝水平。李樹(shù)真等研究了鋅肥對(duì)油菜碳代謝的影響，結(jié)果表明，施用鋅肥能夠提高碳酸酐酶的活性，增強(qiáng)油菜碳素同化能力[9]。楊磊等通過(guò)對(duì)半夏葉片噴施鋅肥發(fā)現(xiàn)，高濃度的鋅肥有利于半夏葉片可溶性糖、可溶性蛋白以及淀粉等碳代謝指標(biāo)的積累[10]。施木田等發(fā)現(xiàn)，鋅、硼營(yíng)養(yǎng)元素可提高苦瓜葉片光合強(qiáng)度、硝酸還原酶活性以及葉綠素、蔗糖、核酸等物質(zhì)含量[11]。以上研究皆是探討鋅肥對(duì)作物碳代謝的影響，而鋅肥對(duì)土壤微生物碳代謝的影響少有研究。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，而細(xì)菌是土壤微生物的主要類(lèi)群，占土壤微生物總量的70%～90%[12-13]。在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、能量循環(huán)過(guò)程中，細(xì)菌發(fā)揮著重要作用，并且細(xì)菌具有根際效應(yīng)，群落分布存在明顯的差異，故分析水稻根際土壤細(xì)菌的碳代謝指紋更能敏感地反映出施用鋅肥導(dǎo)致的土壤生態(tài)環(huán)境變化。鑒于此，本試驗(yàn)以水稻為模式作物，在大田條件下研究鋅肥對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌碳代謝指紋的影響，探討其適宜的施用量，以期為糧食作物生產(chǎn)中鋅肥的合理施用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為湘早143。氮肥為尿素(含N 46%)，磷肥為過(guò)磷酸鈣(含P2O512%)，鉀肥為硫酸鉀(含K2O 60%)，鋅肥為(含7H2O·ZnSO434.5%)。

1.2 大田試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2016年在湖南省湘西土家族苗族自治州進(jìn)行，試驗(yàn)田土壤為黏土壤，pH值為6.1，有機(jī)質(zhì)含量為23.6 g/kg，堿解氮含量為112.4 mg/kg，速效磷含量為18.8 mg/kg，速效鉀含量為123.2 mg/kg，有效鋅含量為0.85 mg/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，即對(duì)照CK(不施鋅肥)、T1(施鋅肥 10 kg/hm2)、T2(施鋅肥20 kg/hm2)、T3(施鋅肥30 kg/hm2)、T4(施鋅肥40 kg/hm2)、T5(施鋅肥50 kg/hm2)。每個(gè)處理重復(fù)3次，共18個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)面積為20 m2，按4 m×5 m規(guī)格劃定筑埂，并用塑料薄膜包裹隔離，實(shí)行單灌單排。小區(qū)整好后栽秧前鋅肥拌細(xì)土作面肥施用。

1.4 樣品測(cè)定方法

采用Garland和Mills的Biolog方法[14]，略有改動(dòng)。在水稻收割后，稱(chēng)取10 g新鮮根際土樣于250 mL滅過(guò)菌的三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌NaCl溶液(0.85%)，封口后在搖床上振蕩30 min(250 r/min)。然后靜置15 min，吸取上清液5 mL于新三角瓶中，加45 mL無(wú)菌NaCl溶液，再將所得溶液稀釋1 000倍，將稀釋液接種到Biolog-ECO培養(yǎng)板上。隨后將其置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，每隔1 d在Biolog微孔板讀數(shù)儀上讀取數(shù)值并記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝途徑的不同，將Biolog-ECO微孔板上31種底物碳源分為6類(lèi)，具體見(jiàn)表1。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行處理，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析及主成分分析。各指標(biāo)計(jì)算公式為[15-17]

AWCD=∑(DC-DR)/n。

(1)

式中：DC、DR分別為反應(yīng)孔、對(duì)照孔在590 nm下的吸光度，n為培養(yǎng)基碳源種類(lèi)數(shù)。

豐富度指數(shù)=-∑(Pi×lnPi)。

(2)

式中：Pi為第i個(gè)孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比值。

(3)

式中：Di為第i孔的相對(duì)吸光度。

優(yōu)勢(shì)度指數(shù)=1-∑Pi2。

(4)

表1 Biolog-ECO微孔板上的碳源類(lèi)型

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源利用能力

2.1.1 各處理平均吸光值動(dòng)態(tài)變化 平均吸光度(AWCD)是評(píng)價(jià)微生物對(duì)碳源底物平均利用能力的一個(gè)重要指標(biāo)，用于反映土壤微生物群落代謝特征，AWCD越高，碳源利用能力越大[18]。由圖1可知，在240 h的培養(yǎng)過(guò)程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻根際土壤細(xì)菌對(duì)碳源的利用能力呈現(xiàn)先不斷提高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在剛開(kāi)始培養(yǎng)的24 h內(nèi)，各類(lèi)碳源被利用得較少，說(shuō)明此時(shí)微生物代謝并不活躍；在24～96 h內(nèi)，AWCD快速增長(zhǎng)，各類(lèi)碳源被大量利用；96 h以后，AWCD趨于平穩(wěn)，碳代謝也達(dá)到了穩(wěn)定的狀態(tài)。

羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)和其他類(lèi)的AWCD整體上均表現(xiàn)為T(mén)5>T4>T3>T2>T1>CK，而在培養(yǎng)96 h后，糖類(lèi)的AWCD也表現(xiàn)為這種現(xiàn)象，說(shuō)明加大鋅肥的施用量，有助于提高細(xì)菌對(duì)羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、其他類(lèi)和糖類(lèi)這4種碳源的利用能力。整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)，6類(lèi)碳源CK處理的AWCD始終最小，表明施用鋅肥可以促進(jìn)細(xì)菌對(duì)碳源底物的利用。

2.1.2 不同處理水稻根際土壤細(xì)菌碳源利用主成分分析 為了進(jìn)一步探究施用鋅肥條件下主要碳源被利用的情況，選擇培養(yǎng)96 h測(cè)定的AWCD，運(yùn)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(表2)。共提取5個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)92.4%，其中第1主成分(PC1)的方差貢獻(xiàn)率為65.9%，第2主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率為11.5%，第3、第4、第5主成分方差貢獻(xiàn)率均較小，未超過(guò)10%，分別為6.3%、5.3%、3.4%。因?yàn)镻C1、PC2這2個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到77.4%，已經(jīng)可以解釋大部分的原變量的特征，所以對(duì)PC1和PC2這2個(gè)主成分進(jìn)行重點(diǎn)分析。

選取PC1和PC2這2個(gè)主成分進(jìn)行分析，以PC1為x軸、以PC2為y軸作圖，以不同處理在2個(gè)主成分上的得分值為坐標(biāo)作圖，得到了圖2。從圖2可以看出，各處理間的碳源利用得分差異非常明顯，分別位于3個(gè)不同的象限。PC1軸上，T1、T2、T3、T4、T5這5個(gè)處理的得分均為負(fù)值，而CK處理為正值，表明PC1上的碳源是區(qū)分施用鋅肥的敏感碳源。PC2軸上，得分值大小順序?yàn)門(mén)3>T2>T5>T4>T1>CK，其中T3處理得分值最高，表明T3處理對(duì)PC2上的主要碳源影響較大；施用鋅肥的處理得分值均大于對(duì)照，說(shuō)明施用鋅肥對(duì)PC2上的主要碳源影響大于不施鋅肥。

碳源載荷值反映了相關(guān)碳源與主因子的相關(guān)性，載荷值越高，表示它對(duì)主成分的影響越大[19-21]。由表3可知，與PC1相關(guān)性較高(載荷值>0.6)的碳源有29個(gè)，其中羧酸類(lèi)和糖類(lèi)最多，均為8個(gè)，兩者占總量的55.2%，氨基酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)和其他類(lèi)分別有6、4、2、1個(gè)；與PC2相關(guān)性較高的碳源有2個(gè)，即2-羥基苯甲酸、D，L-a-磷酸甘油，這兩者分別屬于羧酸類(lèi)和其他類(lèi)。羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)在PC1上相關(guān)性較高的碳源均多于與PC2相關(guān)性較高的碳源個(gè)數(shù)，其他類(lèi)在PC1上相關(guān)性較高的碳源個(gè)數(shù)與PC2相等，均為1個(gè)。PC1上的碳源是區(qū)分施用鋅肥的敏感碳源，結(jié)合圖2可知羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)這5類(lèi)碳源是區(qū)分施用鋅肥的敏感碳源。

2.2 多樣性指數(shù)分析

不同的多樣性指數(shù)可以從不同的方面來(lái)描述微生物群落的多樣性[22]。其中，豐富度指數(shù)用來(lái)表征生態(tài)系統(tǒng)中物種的數(shù)目，優(yōu)勢(shì)度指數(shù)反映各個(gè)種群數(shù)量的變化情況，均一性指數(shù)用來(lái)描述物種中的個(gè)體所占比例[23-25]。本研究利用96 h的平均吸光度來(lái)分析施用鋅肥條件下，水稻土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、均一性指數(shù)的差異。

由圖3可知，不同處理之間均一性指數(shù)差異顯著，豐富度指數(shù)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)無(wú)顯著差異。均一性指數(shù)與鋅肥施用量呈正相關(guān)，隨著鋅肥施用量的增加，均一性指數(shù)不斷增加；T1、T2處理均一性指數(shù)與對(duì)照之間無(wú)顯著性差異，T3、T4、T5處理均一性指數(shù)較對(duì)照分別提高了50%、88.4%、117.4%，且差異顯著，說(shuō)明增施鋅肥有利于均一性指數(shù)的提高。

3 結(jié)論

微生物群落碳源利用能力可以反映微生物活性水平。低濃度的Zn2+不僅可以提高土壤微生物群落對(duì)碳源的利用，還可增加土壤微生物的總體活性[26]。本研究結(jié)果表明，施用鋅肥后，改變了根際土壤細(xì)菌的代謝特征，主要表現(xiàn)為提高了對(duì)羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、其他類(lèi)和糖類(lèi)碳源的利用率，這與龍新憲等的研究結(jié)論[27]相似。這可能是因?yàn)殇\肥的施用平衡了該地區(qū)的土壤養(yǎng)分失調(diào)，改善了土壤結(jié)構(gòu)，為細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)菌的新陳代謝，提高了細(xì)菌的活性，增加了對(duì)碳源的利用。

表2 不同水稻根際土壤細(xì)菌碳源利用主成分分析

研究表明，土壤中鋅含量在適宜范圍內(nèi)，有利于增加土壤微生物群落的豐富度和功能多樣性[28]。在本試驗(yàn)中，鋅肥施用量在20～50 kg/hm2范圍內(nèi)，細(xì)菌均一性指數(shù)與鋅肥施用量呈顯著正相關(guān)。這將促進(jìn)物種區(qū)系向健康的方向轉(zhuǎn)變，對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖有著重要的意義。

主成分分析結(jié)果表明，不同處理下，細(xì)菌對(duì)碳源的利用能力不同。施鋅肥處理(T1、T2、T3、T4、T5)集中分布在PC1負(fù)半軸，而不施鋅肥處理(CK)則位于PC1正半軸；羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)這5類(lèi)碳源在PC1上相關(guān)性較高，綜合分析認(rèn)為，長(zhǎng)期施用鋅肥會(huì)使細(xì)菌偏好羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)物質(zhì)為碳源。

表331種碳源的主成分載荷值

碳源名稱(chēng)載荷值PC1PC2丙酮酸甲脂0.946—吐溫800.938—L-精氨酸0.937—L-絲氨酸0.920—L-苯基丙氨酸0.918—4-羥基苯甲酸0.914—D-木糖0.896—α-D-乳糖0.896—γ-羥基丁酸0.888—D-甘露醇0.883—甘氨酰-L-谷氨酸0.880—α-環(huán)式糊精0.872—苯乙基胺0.849—D-葡萄胺酸0.839—葡萄糖-1-磷酸鹽0.836—L-蘇氨酸0.833—肝糖0.821—D-半乳糖醛酸0.809—吐溫400.798—N-乙?；?D-葡萄胺0.793—衣康酸0.780—I-赤藻糖醇0.772—D-半乳糖內(nèi)酯0.769—D-纖維二糖0.768—D-蘋(píng)果酸0.761—β-甲基D-葡萄糖苷0.744—α-丁酮酸0.716—L-天冬酰胺酸0.685—腐胺0.652—2-羥基苯甲酸—0.625D,L-α-磷酸甘油—0.620