張 謙， 劉一塵， 徐 進(jìn)， 李建正， 劉應(yīng)鵬， 卜昌超， 雷連成

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062； 2.河南后羿實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，河南鄭州 625014； 3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471023)

肉雞大腸桿菌病是致病性大腸埃希氏菌引起的一種急性或慢性細(xì)菌性傳染病[1]，是重要的食源性人畜共患病原菌[2]。大腸桿菌血清型多，各血清型間交叉保護(hù)力低，疫苗免疫效果差，臨床上主要是依靠抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，但抗菌藥物的濫用導(dǎo)致多重耐藥、交叉耐藥、耐藥譜廣的大腸桿菌菌株不斷出現(xiàn)，大腸桿菌病普遍多發(fā)，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。中草藥除具有無耐藥性、無殘留、能增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等優(yōu)點(diǎn)，還具有消除耐藥質(zhì)粒[5-8]、抑制細(xì)菌被膜形成[9-11]的特點(diǎn)，因而成為畜禽疾病防治的研究熱點(diǎn)[12]。但中草藥作為天然藥物，存在藥效不理想、有效成分含量低、結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜等問題，限制了中草藥在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。利用現(xiàn)代中草藥發(fā)酵技術(shù)[13]，可以提高中草藥活性成分含量，改變或產(chǎn)生一些中草藥中不具有的活性成分，將中藥的大分子物質(zhì)，經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化成為能夠被機(jī)體直接吸收的小分子成分，快速達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，提高機(jī)體抗病能力。本研究采用加味白頭翁散及其發(fā)酵產(chǎn)物對野毒分離株大腸桿菌DE感染肉仔雞進(jìn)行防治試驗，并檢測加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞腸道菌群的影響，為加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物防治雞大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

加味白頭翁散由白頭翁60 g、黃連30 g、黃柏45 g、秦皮60 g及黃芪45 g組成，加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物采用3%枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵獲得，均由河南后羿實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供。臨床用法、用量：混飼，2%預(yù)防劑量，4%治療劑量。野毒分離株大腸桿菌DE，由河南科技大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗室提供；伊紅美蘭(eosin-methyleneblue，簡稱EMB)培養(yǎng)基、Pfizer瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、BLB培養(yǎng)基及普通瓊脂培養(yǎng)基，均購自山東青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗動物

2017年4月河南洛陽伊川某肉雞場提供1日齡AA白羽肉仔雞，于河南科技大學(xué)實(shí)驗?zāi)翀龈綦x飼養(yǎng)至5日齡后進(jìn)行分組試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉仔雞大腸桿菌感染模型建立 將野毒分離株大腸桿菌DE在普通瓊脂平板上活化后，挑取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h，對細(xì)菌培養(yǎng)物用LB液體培養(yǎng)基10倍稀釋，使菌懸液濃度分別為 1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL。

10日齡AA白羽肉雞50羽，隨機(jī)分為A、B、C、D及對照組，A、B、C、D分別胸肌注射不同濃度梯度的菌懸液，對照組注射生理鹽水，注射量均為0.5 mL/羽。觀察并記錄72 h內(nèi)試驗雞發(fā)病癥狀、死亡數(shù)量。及時剖檢死亡雞只，采集肝臟、心包分泌物，分離鑒定致病菌株為攻毒菌株。根據(jù)試驗結(jié)果計算半數(shù)致死量(LD50)并作為肉仔雞攻毒保護(hù)試驗的細(xì)菌濃度。采用Reed-muench累計法計算LD50，公式為lgLD50=高于50%死亡率的稀釋度的對數(shù)+距離比例值×稀釋倍數(shù)的對數(shù)；距離比例值 =(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)。

1.3.2 肉仔雞大腸桿菌攻毒防治試驗 選取180羽健康且體質(zhì)量相近的5日齡健康白羽肉仔雞，隨機(jī)分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10羽，即Ⅰ組為加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物預(yù)防組，Ⅱ組為加味白頭翁散預(yù)防組，Ⅲ組為感染對照組，Ⅳ組為健康對照組，Ⅴ組為加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物治療組，Ⅵ組為加味白頭翁散治療組。

Ⅰ、Ⅱ組于攻毒前5 d連續(xù)飼喂含2%加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物、2%加味白頭翁散的基礎(chǔ)日糧；肉仔雞10日齡時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組胸肌注射0.5 mL大腸桿菌菌液，濃度為“1.3.1”節(jié)中半數(shù)致死量濃度，Ⅳ組肉雞胸肌注射0.5 mL生理鹽水，然后，Ⅰ、Ⅴ組和Ⅱ、Ⅵ組分別繼續(xù)飼喂含4%加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物、4%加味白頭翁散的基礎(chǔ)日糧。在用藥防治試驗期間，觀察記錄各組肉仔雞發(fā)病、死亡等各項數(shù)據(jù)，計算試驗雞的發(fā)病率、死亡率、痊愈率及保護(hù)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對肉仔雞發(fā)病率、死亡率、痊愈率、保護(hù)率以及腸道菌群、抗氧化指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉仔雞大腸桿菌感染模型建立

分別將濃度為1×106、1×107、1×108、1×109CFU/mL的野毒分離株大腸桿菌DE懸液進(jìn)行攻毒試驗2 h后，試驗雞開始出現(xiàn)精神萎靡、采食減少或廢絕、畏寒扎堆，發(fā)病率可達(dá)90%以上；攻毒8 h后，試驗雞出現(xiàn)不同程度死亡。剖檢死亡雞只，出現(xiàn)心包炎、肝周炎及盲腸、十二指腸出血等典型的大腸桿菌病病變。分離鑒定致病菌株，均呈現(xiàn)野毒分離株大腸桿菌DE典型的染色特性及培養(yǎng)特性，可確定致病菌為野毒分離株大腸桿菌DE。

采用Reed-muench累計法計算野毒分離株大腸桿菌DE對試驗雞的半數(shù)致死量為LD50=106.33CFU/mL(表1)。最終確定野毒分離株大腸桿菌DE發(fā)病模型：細(xì)菌濃度為106.33CFU/mL，0.5 mL/羽，感染途徑為胸肌注射。

表1 野毒分離株大腸桿菌DE LD50測定

2.2 肉仔雞大腸桿菌攻毒防治試驗

野毒分離株大腸桿菌DE以半數(shù)致死劑量感染肉仔雞，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，2 h后，預(yù)防Ⅰ、Ⅱ組肉仔雞僅個別雞出現(xiàn)畏寒怕冷、精神不振等癥狀，未出現(xiàn)死亡情況，至試驗結(jié)束時，精神、飲食狀況恢復(fù)正常。感染Ⅲ組至8 h開始出現(xiàn)死亡，24～48 h出現(xiàn)死亡高峰，整個試驗過程中大部分雞出現(xiàn)精神不振、食欲減少等癥狀?？瞻讓φ战M雞精神、食欲、飲水正常，無雞死亡現(xiàn)象。治療Ⅴ、Ⅵ組12 h開始出現(xiàn)死亡，24～48 h 出現(xiàn)死亡高峰。

結(jié)果(表2)表明，預(yù)防Ⅰ組肉仔雞與感染對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組相比死亡率率明顯下降，保護(hù)率極顯著上升(P<0.01)，表明加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對人工感染野毒分離株大腸桿菌DE的肉仔雞有較強(qiáng)的預(yù)防作用；預(yù)防Ⅱ組肉仔雞感染與對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組相比死亡率明顯下降，保護(hù)率極顯著上升(P<0.01)，表明加味白頭翁散對人工感染野毒分離株大腸桿菌DE的肉仔雞也具有較強(qiáng)的預(yù)防作用，但效果不如加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物。感染對照Ⅲ組、治療Ⅴ組、Ⅵ組的保護(hù)率差異不顯著。

表2 加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞人工感染

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。表3同。

2.3加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞腸道菌群的影響

將大腸桿菌、腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌等的菌群數(shù)量采用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表3。

由表3可見，預(yù)防Ⅰ組、Ⅱ組以及治療Ⅴ組、Ⅵ組肉仔雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量極顯著低于感染對照組(P<0.01)，均與健康對照組差異不顯著(P>0.05)；腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌等的菌群數(shù)量均極顯著高于感染對照組(P<0.01)，預(yù)防組腸球菌、雙歧桿菌數(shù)量與健康對照組差異不顯著(P>0.05)，芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量與健康對照組差異極顯著(P<0.01)。預(yù)防Ⅰ組、Ⅱ組及治療Ⅴ組、Ⅵ組肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數(shù)量差異不顯著(P>0.05)；預(yù)防Ⅰ組、Ⅱ組肉仔雞盲腸中腸球菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌的菌群數(shù)量略高于治療Ⅴ組、Ⅵ組，差異極顯著(P<0.01)；預(yù)防Ⅰ組肉仔雞盲腸中芽孢桿菌、乳酸菌的菌群數(shù)量略高于預(yù)防Ⅱ組，差異顯著(P<0.05)。

表3 加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞腸道菌群的影響

3 討論與結(jié)論

在抗生素選擇性壓力下，大腸桿菌耐藥菌株呈交叉耐藥和多重耐藥趨勢，而95%耐藥基因位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子及噬菌體等可轉(zhuǎn)移遺傳元件上，從而造成細(xì)菌耐藥性的廣泛傳播。尤其是大腸桿菌耐藥性質(zhì)粒，不僅可在同種、不同種微生物細(xì)胞間傳遞，而且可作為動物和人類抗生素耐藥基因庫，使耐藥基因通過食物鏈在動物抗生素耐藥共生菌和人體攜帶菌之間轉(zhuǎn)移。近年來研究表明，具抑菌作用的中草藥對大腸桿菌耐藥質(zhì)粒有消除作用，如蒼術(shù)[5]、黃芩[6]、黃連[7]、地錦草[8]等。

大腸桿菌耐藥性還與大腸桿菌侵入機(jī)體器官或部位形成生物被膜有關(guān)聯(lián)。形成生物被膜的大腸桿菌進(jìn)入一種饑餓的非生長狀態(tài)[14]，對抗生素幾乎完全不敏感；大腸桿菌的三維生物被膜結(jié)構(gòu)可有效阻礙抗生素的穿透，在通常情況下，只有少量抗生素滲透到生物被膜內(nèi)，其濃度并不足以有效殺滅深部細(xì)菌；大腸桿菌形成生物被膜后可隨著環(huán)境的變化具有特有的抗生素逃避機(jī)制。姚禹等研究表明，單味中藥、復(fù)方中藥或中藥單體對大腸桿菌生物被膜的形成具有很好的抑制作用[9-11]。

中草藥對腸道有益菌具有促生長作用，為益生菌的生長繁殖提供營養(yǎng)條件，增加腸道益生菌(如雙歧桿菌、乳酸菌、糞鏈球菌等)的種類和數(shù)量，抑制有害菌的生長和增殖，甚至還能抑制或殺滅有害菌，對動物機(jī)體健康發(fā)揮著關(guān)鍵作用[15]。而中草藥發(fā)酵是微生物在溫和條件下新陳代謝過程中產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等多種胞外酶系，降解植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠等成分，促進(jìn)活性成分的釋放，催化其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行氧化、酯化、甲基化和還原化等生物反應(yīng)，最大限度地提取中草藥活性成分或轉(zhuǎn)化原成分，分解毒性物質(zhì)，可促進(jìn)藥物有效成分被吸收，以提高機(jī)體抗病能力[16-17]。

本研究結(jié)果表明，加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞感染野毒分離株大腸桿菌DE的保護(hù)作用比加味白頭翁散強(qiáng)；加味白頭翁散及加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物對肉仔雞感染野毒分離株大腸桿菌DE的預(yù)防效果比治療效果好。加味白頭翁散及加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物處理的肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數(shù)量極顯著低于感染對照組(P<0.01)，腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌的菌群數(shù)量均極顯著高于感染對照組(P<0.01)。飼喂加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物肉仔雞盲腸中大腸桿菌的菌群數(shù)量略低于飼喂加味白頭翁散，腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌及芽孢桿菌的菌群數(shù)量略高于飼喂加味白頭翁散，腸球菌、雙歧桿菌的菌群數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，乳酸菌、芽孢桿菌的處理間差異顯著(P<0.05)。因此，加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物能有效預(yù)防肉仔雞大腸桿菌病，對恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡、保持動物機(jī)體健康狀況具有重要作用，這也為加味白頭翁散發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。