彭 浩， 吳 畏， 師艷秋， 王 賢， 宋文路

(1.濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜 273155； 2.山東凱斯達(dá)機(jī)械制造有限公司，山東濟(jì)寧 272000)

香菇[Lentinusedodes(Berk.) Sing]為擔(dān)子菌綱傘形科真菌，是世界上重要的食用菌兼藥用菌之一。人們將真菌多糖作為藥物進(jìn)行研究始于20世紀(jì)50年代，在20世紀(jì)60年代以后，真菌多糖作為免疫促進(jìn)劑受到廣泛關(guān)注，其中香菇多糖(lentinan，簡(jiǎn)稱LNT)是研究得較為透徹的多糖之一[1]。LNT具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、提高免疫力[4]、抗氧化[5]和刺激干擾素形成等功能，是一種重要的生理活性物質(zhì)，因而被廣泛地應(yīng)用于藥品、食品保健等行業(yè)中。

目前，關(guān)于LNT提取的研究較多。提取LNT的經(jīng)典方法為水提醇沉法，該法成本低廉、易于操作、工藝簡(jiǎn)明。但是，熱水浸提法采用的浸提溫度為70～80 ℃，耗能多，提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率低。另一類常見(jiàn)的提取方法為酸法、堿法，但提取過(guò)程不容易控制反應(yīng)條件，且酸堿濃度過(guò)高時(shí)會(huì)有腐蝕性，多糖結(jié)構(gòu)極可能遭到破壞，導(dǎo)致香菇多糖分子量下降，造成其生物活性的降低。目前，多種新技術(shù)如超聲波輔助提取、微波輔助提取、酶法輔助提取、半仿生提取的使用在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)工藝的缺陷[6-7]。其中，微波預(yù)處理-超聲波提取法[8]能較好地結(jié)合微波提取法和超聲波提取法兩者的優(yōu)點(diǎn)，利用微波的熱效應(yīng)(內(nèi)加熱)使原料的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜迅速溶脹破裂，再利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)使溶劑快速滲入細(xì)胞內(nèi)部，從而使有效成分迅速溶解并快速離開細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，進(jìn)入主體溶劑。微波預(yù)處理-超聲波提取法既能快速高效地提取物料中的有效成分，也能避免微波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而引發(fā)的不良效果，確保有效成分最大限度地被提取，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦吞崛〖夹g(shù)[5]。

目前已有關(guān)于微波預(yù)處理-超聲波提取山茱萸多糖及其穩(wěn)定性研究的報(bào)道[9]，也有關(guān)于經(jīng)微波預(yù)處理-超聲波提取的LNT抗氧化活性的研究[5]，且后者在固定微波和超聲波功率條件下對(duì)微波時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。本研究以香菇多糖提取率為指標(biāo)，在微波功率為250 W、時(shí)間為30s的固定預(yù)處理?xiàng)l件下，通過(guò)對(duì)料液比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件，并研究經(jīng)本工藝條件提取的LNT的抗氧化活性，以期為L(zhǎng)NT的新型提取工藝研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：品種為黑面菇，產(chǎn)于浙江省，市售。所使用試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA12002電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；GBSY-4電熱恒溫水浴鍋，北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責(zé)任公司；TGL-16B臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52多用途旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TU-1900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG9070電熱鼓風(fēng)干燥箱，濟(jì)寧市精宏儀器有限公司；FS30C 攪拌粉碎機(jī)，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；WD7007L23-K5微波爐，廣東格蘭仕電器銷售有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程 香菇洗凈烘干→粉碎→水溶→微波預(yù)處理→超聲波處理→過(guò)濾→上清液蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀→離心→在沉淀中加木瓜蛋白酶→離心→上清液二次醇沉→靜置過(guò)夜→無(wú)水乙醇洗滌→稀釋粗多糖提取液→測(cè)定。

1.3.2 操作要點(diǎn) 將香菇洗凈，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，用攪拌粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。將制成的香菇粉置于棕色瓶?jī)?nèi)密封保存?zhèn)溆?。稱取1.0 g香菇粉置于錐形瓶中，加入蒸餾水溶解。用微波(功率為250 W)預(yù)處理30 s后，在超聲波清洗器中按照既定條件進(jìn)行超聲波處理，處理后將溶液于4 000 r/min離心10 min，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至一定體積后，加入3倍體積的無(wú)水乙醇，在 4 ℃ 條件下靜置過(guò)夜。將提取液于4 000 r/min離心 20 min。加入蒸餾水溶解沉淀，加入1%～2%木瓜蛋白酶，以稀HCl調(diào)節(jié)pH值為8.0，于55 ℃水浴中放置2 h。除蛋白后于 4 000 r/min 離心20 min；在上清液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，于4 ℃靜置過(guò)夜。于4 000 r/min離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌，即得LNT。稀釋粗多糖提取液，測(cè)定多糖提取率。

1.3.3 LNT提取率的測(cè)定 多糖提取率的測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法[10]。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，精確配制濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次量取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水定容至1.0 mL。加入0.5 mL 6%苯酚、2.5 mL濃H2SO4，搖勻，沸水浴20min，室溫放置20 min，于490 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、D490 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算多糖提取率：

(1)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的多糖濃度，g/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；D為L(zhǎng)NT的稀釋倍數(shù)；m為香菇原料質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 影響LNT提取率的因素較多，如料液比、提取溫度和時(shí)間、提取次數(shù)、pH值等。以微波法作為樣品的預(yù)處理方法，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

(1)料液比。取在不同料液比下經(jīng)微波預(yù)處理后的香菇溶液，在超聲波提取功率為60 W、超聲波提取溫度為40 ℃、超聲波提取時(shí)間為15 min的條件下，考察不同料液比(1 g ∶10 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶40 mL、1 g ∶50 mL)對(duì)LNT提取率的影響。

(2)超聲波提取溫度。將料液比設(shè)為1 g ∶30 mL，在微波預(yù)處理后的香菇溶液超聲波提取功率為60 W、超聲波提取時(shí)間為15 min的條件下，研究不同超聲波提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)LNT提取率的影響。

(3)超聲波提取時(shí)間。將料液比設(shè)為1 g ∶30 mL，在微波預(yù)處理后的香菇溶液超聲波提取功率為60 W、超聲波提取溫度為40 ℃的條件下，考察不同超聲波提取時(shí)間(10、15、20、25、30 min)對(duì)LNT提取率的影響。

(4)超聲波提取功率。將料液比設(shè)為1 g ∶30 mL，在微波預(yù)處理后的香菇溶液超聲波提取溫度為40 ℃、超聲波提取時(shí)間為15 min的條件下，考察不同超聲波提取功率(60、70、80、90、100 W)對(duì)LNT提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率4個(gè)因素的各3個(gè)適宜水平，按照L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.6 LNT的抗氧化活性分析

1.3.6.1 總抗氧化能力的測(cè)定 采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法測(cè)定總抗氧化能力[11-12]。取1 mL不同質(zhì)量濃度的LNT水溶液進(jìn)行試驗(yàn)，空白組用去離子水代替，對(duì)照組用同等質(zhì)量濃度的維生素C代替，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。以1.0 mmol/L FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4濃度(μmol/L)表示，即為FRAP值。

表1 4因素3水平正交試驗(yàn)因素水平

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考李亞輝等的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力[12-13]。取1 mL不同質(zhì)量濃度的LNT水溶液，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，空白組用水代替樣品，對(duì)照組用同等質(zhì)量濃度的維生素C代替，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。相關(guān)公式如下：

(2)

式中：D1為樣品組的吸光度；D0為對(duì)照組的吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 采用2-脫氧核糖法測(cè)定羥自由基清除能力[12，14]。取500 μL不同質(zhì)量濃度的LNT水溶液進(jìn)行試驗(yàn)，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，空白組用水代替樣品，對(duì)照組用同等質(zhì)量濃度的維生素C代替，每個(gè)樣品重復(fù)3次。相關(guān)公式如下：

(3)

式中：D1為樣品組的吸光度；D0為空白組的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel 2007和SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y= 6.536x+0.04，r2=0.99(圖1)。式中：y為吸光度；x為質(zhì)量濃度(mg/mL)。由圖1可見(jiàn)，該法的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.01～0.1 mg/mL范圍內(nèi)能很好地符合線性要求，可以用來(lái)進(jìn)行LNT含量測(cè)定。

2.2 單因素研究

2.2.1 料液比對(duì)LNT提取率的影響 由圖2可知，在料液比為1 g ∶10 mL～1 g ∶30mL的范圍內(nèi)，LNT提取率隨著料液比提高而顯著增加。在料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶50 mL的范圍內(nèi)，隨著料液比的提高，提取率反而降低。在LNT提取過(guò)程中，水起到超聲波介質(zhì)的作用。溶劑用量較少時(shí)，原料細(xì)胞組織浸潤(rùn)不完全，使得提取效果較差。隨著料液比的提高，溶劑量增大，從而使超聲波的介質(zhì)增多，降低了多糖物質(zhì)向外擴(kuò)散的阻力，進(jìn)而使LNT提取率不斷提高[15]。然而，過(guò)多的溶劑會(huì)消耗大量超聲波輻射能量，進(jìn)而影響多糖的析出[9]。當(dāng)料液比為1 g ∶30 mL時(shí)，多糖提取率最高，為5.35%。因此可見(jiàn)，在單因素條件下，1 g ∶30 mL為最佳料液比。

2.2.2 超聲波提取溫度對(duì)LNT提取率的影響 由圖3可知，香菇多糖的提取率首先隨著超聲提取溫度的增加而提高，當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，多糖提取率最高，可達(dá)5.68%；當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，多糖提取率顯著降低。溫度過(guò)高可能使多糖溶液黏度增加，且使部分多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使其提取率降低。因此可見(jiàn)，在單因素條件下，60 ℃為最佳超聲提取溫度。

2.2.3 超聲波提取時(shí)間對(duì)LNT提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為10～20 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，LNT提取率顯著提高；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，多糖提取率最高，為5.73%；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)20 min后，多糖提取率開始下降。這說(shuō)明多糖提取過(guò)程與超聲波處理時(shí)間密切相關(guān)，超聲波處理時(shí)間短，多糖溶出得不充分；超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，使組織中的大量細(xì)胞進(jìn)一步破裂，從而使細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)等混入提取液中，溶液中雜質(zhì)增多，黏度增大，從而增大了傳質(zhì)阻力，影響了多糖成分的溶出。另一方面，可能是隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波較強(qiáng)的空化和機(jī)械振動(dòng)使部分多糖大分子鏈斷裂，其小分子的糖在醇沉處理過(guò)程中損失了，從而降低了多糖的提取率[16]。因此可見(jiàn)，在單因素條件下，20min為最佳超聲提取時(shí)間。

2.2.4 超聲波提取功率對(duì)LNT提取率的影響 由圖5可知，在60～70 W的超聲功率范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，LNT的提取率也在提高，當(dāng)超聲功率為70 W時(shí)，多糖提取率最高，為6.25%。原因可能是隨著超聲功率的增加，超聲空化效應(yīng)、高速射流以及機(jī)械剪切的攪拌作用等加強(qiáng)，有效地減少了水與粉末間的阻滯，使細(xì)胞得到更加充分的破裂，從而加速了細(xì)胞中多糖分子在水中的溶出。當(dāng)功率超過(guò)70 W時(shí)，LNT的提取率開始下降。這可能是由于大功率的物理剪切作用及其引起的局部溶液瞬時(shí)升溫過(guò)熱，造成部分多糖分子鏈的斷裂而降解，使多糖糖苷鍵被打斷，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，在后處理中造成了損失，從而使多糖提取率降低[17]。因此可見(jiàn)，在單因素條件下，超聲波提取功率應(yīng)以70 W為宜。

2.3 LNT微波預(yù)處理超聲波提取法最佳條件的確定

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2可以看出，RD>RB>RC>RA，可知超聲波功率的變化對(duì)多糖提取率的影響最明顯，進(jìn)一步說(shuō)明超聲波在該提取方法中的重要作用。其他對(duì)多糖提取率影響較大的因素依次為超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比。由k值得到最優(yōu)水平為A3B2C2D3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 LNT提取率方差分析 為了進(jìn)一步確定微波預(yù)處理超聲波法提取LNT的最佳工藝條件，對(duì)試驗(yàn)誤差試驗(yàn)條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行評(píng)估和判斷，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。由表3可知，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度以及超聲功率都會(huì)影響多糖的提取率，其中超聲時(shí)間、超聲溫度以及超聲功率3個(gè)因素的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。由于料液比對(duì)于提取率的影響并不顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)的影響不大，本著高效節(jié)約的原則，確定A2為A因素的最佳水平。綜合以上分析，確定最佳工藝條件組合為A2B2C2D3，即料液比為1 g ∶20 mL、超聲波處理時(shí)間為20 min、超聲溫度為 60 ℃、超聲功率為80 W。

表3 方差分析結(jié)果

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)通過(guò)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行最優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，3次平行試驗(yàn)的平均提取率為7.16%，明顯高于其他條件下的LNT提取率。

2.4 LNT的體外抗氧化性分析

2.4.1 LNT的總抗氧化能力 由圖6可知，LNT的總抗氧化能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為 25 mg/mL 時(shí)，其總抗氧化能力約達(dá)到95.39 μmol/L，說(shuō)明所提取的LNT具有一定的總抗氧化能力。但與相同質(zhì)量濃度的維生素C相比，LNT的FRAP值較小，說(shuō)明LNT的總抗氧化能力略低。

2.4.2 LNT對(duì)DPPH自由基的清除能力 由圖7可知，當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為0～25 mg/mL時(shí)，LNT對(duì)DPPH自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的升高而提高。當(dāng)質(zhì)量濃度為 25 mg/mL 時(shí)，其DPPH自由基清除率達(dá)到76.22%。與相同質(zhì)量濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品相比，LNT對(duì)DPPH自由基的清除率略大，說(shuō)明LNT具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.4.3 LNT對(duì)羥自由基的清除能力 由圖8可知，當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為0～15 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除能力增加得較快；當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為15～25 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥自由基的清除能力增加得較慢；當(dāng)LNT質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)最大值，為92.41%。LNT對(duì)羥自由基的清除效果略高于同質(zhì)量濃度的維生素C，說(shuō)明所提取的LNT具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

3 結(jié)論

本研究工藝采用微波預(yù)處理-超聲波輔助法提取香菇多糖，得到其最優(yōu)化工藝條件：微波功率為250 W，預(yù)處理時(shí)間為30 s，料液比為1 g ∶20 mL，超聲功率為80 W，溫度為 60 ℃，超聲時(shí)間為20 min。在此優(yōu)化條件下，LNT提取率為7.16%，明顯高于目前常見(jiàn)新技術(shù)的提取率，如超聲波輔助提取法(6.47%)[18]、微波輔助提取法(6.49%)[19]、超聲波與酶協(xié)同提取法(6.94%)[15]。本工藝過(guò)程使用的微波與超聲波功率較低，無(wú)加熱等其他工藝，極大地降低了能源消耗，且提取的LNT具有良好的體外抗氧化活性。由此可見(jiàn)，LNT的微波預(yù)處理-超聲波輔助提取工藝既對(duì)節(jié)能環(huán)保提供了很好的思路，也可為L(zhǎng)NT的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。