何俊霖， 于思， 曹治興， 王雯雯， 張若琪， 李玉芝， 彭成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源重點實驗室，成都611137)

斑馬魚Danioreriovar.是一種重要的脊椎動物模型，其主要生理組織結構、基因遺傳、生物信號調(diào)控以及疾病特征等與人類相似，在生命科學研究中已經(jīng)成為被世界廣泛關注的主要模式生物之一。另外，斑馬魚具有個體小、繁殖能力強、易于大量養(yǎng)殖、其透明胚胎能夠直接觀察生理結構變化等多種優(yōu)點。同時，斑馬魚對測試藥物需求量少，是一種非常適用于中藥有效成分藥理學研究的動物模型(彭蘊茹等，2017)。

異甘草素是一種廣泛存在于甘草、黃芪、紅芪、滇黃精等中藥內(nèi)的異黃酮類化合物(展翔，2018)，具有多重藥理活性，可抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物，對肝以及心血管有一定的保護作用(Zhaoetal.，2015；Gauretal.，2016；Tanigawaetal.，2016；Gaoetal.，2017；Houetal.，2017；Huetal.，2017)。目前，有關異甘草素的體實驗研究以嚙齒動物為主，而以斑馬魚為模型的研究甚少。本研究以異甘草素作用于斑馬魚胚胎，研究其對斑馬魚胚胎發(fā)育、血管生成及其心臟發(fā)育的影響，以期為異甘草素的深入研究和開發(fā)提供參考價值。

1 材料

1.1 藥物與實驗動物

異甘草素(批號：YGCS20160418，南京春秋生物工程有限公司)用二甲基亞砜(DMSO，批號：SHBG6226V，美國Sigma-Aldrich公司)配成10 mg·mL-1的紫草素母液，實驗時使用含0.001 5%N-苯基硫脲(PTU，批號：BCBK8912V，美國Sigma-Aldrich公司)的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。舒尼替尼購于南京康滿林化工實業(yè)有限公司(批號：S46150)。

1.2 實驗儀器與主要試劑

斑馬魚繁育系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展有限公司)；MGC-100型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；M165-FC型體式熒光顯微成像系統(tǒng)(德國Leica公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號：M0202A，大連美侖生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 斑馬魚胚胎的飼養(yǎng)及獲取

斑馬魚為血管綠色熒光標記的Tg(flk1∶GFP)轉基因AB品系，由成都中醫(yī)藥大學藥學院斑馬魚實驗平臺自主繁育。飼育條件為：北京愛生斑馬魚繁育系統(tǒng)，全封閉循環(huán)，水溫28 ℃，室溫26 ℃，pH7.2～7.5，電導率500～550 μs·cm-1，光照14 h/黑暗10 h交替。選擇生長狀態(tài)良好的斑馬魚以雌雄比=1∶1進行繁育，用隔板將雌雄分開，于次晨抽去隔板，2 h后收集斑馬魚胚胎，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。

2.2 斑馬魚胚胎畸形率與存活率的測定

選取受精后10 h、24 h(hours post fertilization，hpf)發(fā)育正常的斑馬魚胚胎隨機置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度分別為4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1、14 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對照，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于給藥12 h、24 h、36 h、48 h后在顯微鏡下觀察記錄胚胎畸形率與存活率，并拍照。每組實驗重復3次。斑馬魚胚胎由透明變?yōu)榘咨蛟陲@微鏡下觀察胚胎開始變模糊判定為胚胎死亡?；温视嬎愎綖椋夯温?畸形胚胎數(shù)/(胚胎總數(shù)-死亡胚胎數(shù))×100%。

2.3 異甘草素對斑馬魚胚胎血管生成的影響

斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，其節(jié)間在10 hpf開始發(fā)育，此時血管開始發(fā)育，到36 hpf基本發(fā)育完全(Kimmeletal.，1995)，故選取10 hpf斑馬魚胚胎研究異甘草素對其血管生成的影響。取10 hpf發(fā)育正常的斑馬魚胚胎隨機置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、8 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對照，并增設1 μg·mL-1舒尼替尼藥液作為陽性對照，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，注射針脫模后，用1%CMC-Na固定在有凹槽的載玻片上，使其雙眼、體節(jié)重合，在熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚血管的熒光圖像。實驗重復3次。

2.4 斑馬魚胚胎心率的測定

斑馬魚胚胎心臟在24 hpf左右開始搏動，72 hpf心臟形態(tài)發(fā)育基本完成，心臟搏動也逐漸變得強而有力且趨于平穩(wěn)(Kimmeletal.，1995)，故選擇 24 hpf斑馬魚胚胎研究異甘草素對斑馬魚心臟發(fā)育的影響。取24 hpf發(fā)育正常的斑馬魚胚胎隨機置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對照，每12 h記錄30 s內(nèi)的心率，至給藥后48 h。實驗重復3次。

2.5 斑馬魚胚胎心臟形態(tài)的觀察

取24 hpf發(fā)育正常的斑馬魚胚胎隨機置于24孔板，每孔15枚，按2.2方法給藥，恒溫培養(yǎng)48 h后，用1%CMC-Na固定，在體視顯微鏡下拍攝心臟形態(tài)圖像。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

3 結果

3.1 異甘草素對斑馬魚胚胎畸形率的影響

異甘草素在≥6 μg·mL-1劑量下可明顯導致10 hpf、24 hpf斑馬魚胚胎發(fā)生畸形，并隨著濃度升高，畸形率升高(圖1，圖2)。異甘草素對10 hpf斑馬魚胚胎作用24 h后，與空白對照組相比，4 μg·mL-1異甘草素組個別胚胎尾部略顯彎曲，8 μg·mL-1異甘草素組脊柱出現(xiàn)輕度彎曲，而12 μg·mL-1異甘草素組尾部嚴重彎曲(圖3)，且隨著用藥量的增大，斑馬魚胚胎體型也不同程度地變短變小。

3.2 異甘草素對斑馬魚胚胎存活率的影響

異甘草素對10 hpf、24 hpf斑馬魚胚胎存活率的影響見表1、表2，異甘草素濃度為6 μg·mL-1時胚胎開始出現(xiàn)死亡，濃度越大、作用時間越長，胚胎存活率越低，且24 hpf斑馬魚胚胎較10 hpf的存活率降低幅度更大。

圖1 異甘草素對10 hpf斑馬魚胚胎畸形率的影響(n=3)Fig. 1 Effect of isoliquiritigenin on the deforming rate of zebrafish embryos at 10 hpf (n=3)

圖3 異甘草素作用于10 hpf斑馬魚胚胎24 h對胚胎發(fā)育的影響(5×)Fig. 3 Effect of isoliquiritigenin on the growth and development of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

箭頭指向斑馬魚胚胎畸形部位

Arrows point to the deformed part of the zebrafish embryos

3.3 異甘草素對斑馬魚胚胎血管生成的影響

與空白對照組相比，異甘草素濃度為2 μg·mL-1時即可抑制斑馬魚胚胎血管的生成，且濃度增加，作用越強，當異甘草素濃度為8 μg·mL-1時，側血管完全被抑制，其抑制作用強于陽性對照組(圖4)。

表1 異甘草素對10 hpf斑馬魚胚胎存活率的影響Table 1 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 10 hpf

注： 與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Notes： Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01； the same below

表2 異甘草素對24 hpf斑馬魚胚胎的存活率的影響Table 2 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 24 hpf

圖4 異甘草素作用于10 hpf斑馬魚胚胎24 h對血管生成的影響(5×)Fig. 4 Effect of isoliquiritigenin on the angiogenesis of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

3.4 異甘草素對斑馬魚胚胎心率的影響

異甘草素作用于24 hpf斑馬魚胚胎的心率見表3，同一時間點的斑馬魚胚胎，與空白對照組相比，給藥組斑馬魚的心率極顯著降低，且異甘草素濃度越高，心率越低?？瞻讓φ战M中，12～48 h斑馬魚胚胎心率呈逐漸增加的趨勢，異甘草素濃度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1時，也呈現(xiàn)心率漸增的趨勢，而濃度為6 μg·mL-1、8 μg·mL-1時，卻出現(xiàn)先降低后升高的趨勢，濃度為10 μg·mL-1、12 μg·mL-1時，則呈心率逐漸降低的趨勢。

3.5 異甘草素對斑馬魚胚胎心臟形態(tài)的影響

與空白對照組相比，給藥組斑馬魚胚胎的心包(圖5：A中實線圈區(qū)域)與卵黃囊(圖5：A中虛線圈區(qū)域)腫大，且腫大程度呈劑量依賴。此外，當異甘草素濃度為8 μg·mL-1時，胚胎開始出現(xiàn)輕微血液淤滯現(xiàn)象(箭頭指示部位)，當異甘草素濃度為12 μg·mL-1時，表現(xiàn)為嚴重的血液淤滯現(xiàn)象。

4 討論

異甘草素廣泛存在于甘草、黃芪、紅芪、滇黃精等多味常用無毒中藥。然而，本研究結果顯示，異甘草素可影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，中低劑量對斑馬魚胚胎有一定的致畸性，而高劑量對斑馬魚胚胎產(chǎn)生明顯的致畸和致死性。本研究結果所表現(xiàn)出的“毒性”主要是由于本研究所測試異甘草素濃度較高。后續(xù)實驗結果表明，異甘草素在中低劑量下可表現(xiàn)出明顯的抑制血管生成和降低心率的作用，表明其具有一定的安全性。

表3 異甘草素作用于24 hpf斑馬魚胚胎心率的影響(n=10)Table 3 Effect of isoliquiritigenin on the heart rate of zebrafish embryos at 24 hpf (n=10)

圖5 異甘草素作用于24 hpf斑馬魚胚胎48 h對心臟形態(tài)的影響(8×)Fig. 5 Effect of isoliquiritigenin on the cardiac morphology of zebrafish embryos at 24 hpf for 48 h (8×)

實線圈區(qū)域為斑馬魚心包， 虛線圈區(qū)域為斑馬魚卵黃囊； 箭頭處為斑馬魚血液淤滯部位

Real coil area is zebrafish’s pericardium， and imaginary coil area is zebrafish’s saccus omphaloentericus； arrows point to stagnant part of the zebrafish blood

血管生成一般是在已有血管的基礎上，由血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、管腔形成等一系列步驟組合的生物學過程(Vandekeereetal.，2015)。研究表明，血管異常生成是癌癥、炎癥、老年黃斑變性等疾病的主要促進因素，目前已有舒尼替尼、貝伐單抗等多種血管生成抑制劑用于相關疾病的治療(Carmeliet & Jain，2000；Yadavletal.，2015)。本研究以舒尼替尼為陽性對照，證實了異甘草素可顯著抑制斑馬魚胚胎血管的生成，異草甘素濃度為2 μg·mL-1時可顯示出抑制作用。已有研究報道，異甘草素對膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、胃癌以及其他多種癌細胞具有一定的抗腫瘤活性(Linetal.，2016；Gaoetal.，2017；Huangetal.，2017；Moreno-Londonoetal.，2017；Zhangetal.，2018)。異甘草素可呈劑量依賴型抑制VEGF/VEGFR-2以及MAPK信號通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖、管狀形成、侵襲和遷移能力，進而發(fā)揮抗腫瘤作用(Kangetal.，2010；Wangetal.，2013)。因此，推測本研究中異甘草素主要以抑制內(nèi)皮細胞生成、遷移和管狀形成的形式抑制血管生成。

心率是反映心臟功能的重要指標。本研究顯示，異甘草素作用于24 hpf斑馬魚胚胎，整體上有減慢心率的作用。有文獻報道(Noguchietal.，2008；Zhangetal.，2009，2013)，異甘草素可激活心肌保護信號通路，保護心臟免受缺血再灌注損傷和抗心律失常的作用，并可通過AMPK信號通路改善缺氧心肌細胞收縮功能障礙。其次，異甘草素可通過增加L型Ca2+電流對心臟產(chǎn)生正性肌力效應并對K+電流有一定的抑制作用。本研究結果提示，異甘草素可顯著降低斑馬魚胚胎心率，隨著作用時間延長，中低劑量組(2～8 μg·mL-1)斑馬魚胚胎心率又呈現(xiàn)先降低再略有升高的趨勢，推測異甘草素在該濃度范圍內(nèi)對斑馬魚胚胎心臟有一定的保護作用，其保護作用可能與上述作用有關。而在劑量較高時(≥10 μg·mL-1)，對心率具有持續(xù)的抑制和誘發(fā)心臟畸形的作用，提示高劑量異甘草素會產(chǎn)生毒副作用。

綜上所述，中低劑量異甘草素對斑馬魚胚胎具有良好的抗血管生成和減慢心率的作用，而高劑量有一定毒性。但客觀來看，藥物均有一定偏性，關鍵在于如何將藥效最大化而毒性最小化，只要科學合理使用，定能發(fā)揮藥物的長處，服務于人民大眾。