曹鑫盛， 劉興， 蔡鋒隆， 陳秋陽， 張奇杰， 陳成勛*

(1. 天津農學院水產學院，天津300384； 2. 天津農學院，水產生態(tài)與養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心，天津300384； 3.天津農學院水產科學系，天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384； 4. 廣西大學動物科學技術學院，南寧530004；5. 天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384； 6. 南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京210095；7. 天津市隆錦水產養(yǎng)殖有限公司，天津300384)

鋸緣閉殼龜Cuoramouhotii(Gray，1862)，舊稱鋸緣攝龜Pyxideamouhotii(Gray，1862)(Yasukawaetal.，2001；Hondaetal.，2002；Stuart & Parham，2004)，屬雜食性半水棲龜類，主要棲息在潮濕森林地表的淺水區(qū)附近，以各類小型無脊椎動物、軟質果實、蘑菇等為食，偶爾進食小型動物尸體(Fischeretal.，2010)。鋸緣閉殼龜有2個亞種，即指名亞種C.mouhotiimouhotii(Gray，1862)和奧氏亞種(越南亞種)C.mouhotiiobsti(周婷，李丕鵬，2013)，分布于中國(廣東、廣西、海南、湖南、云南)，印度(阿扎爾邦、阿薩姆邦、梅加拉亞、米佐拉姆)，老撾，緬甸，泰國和越南(van Dijketal.，2012)。由于棲息地不斷縮小、天敵和過度獵捕，野生鋸緣閉殼龜已日漸減少，被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)附錄Ⅱ(UNEP-WCMC，2017)，世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄瀕危(EN)物種(Asian Turtle Trade Working Group，2000)，中國脊椎動物紅色名錄極危(CR)物種(蔣志剛等，2016)。

在龜類資源遭到嚴重破壞的狀況下，人工養(yǎng)殖可以減輕野生種群的壓力、保存物種資源、避免滅絕的風險，被認為是挽救龜類的有效方法之一。鋸緣閉殼龜具有繁殖率低下、繁殖周期長、生長緩慢(Wangetal.，2011)及在實驗中觀察到的雄性個體間相互攻擊嚴重(領地意識強)等不利于人工飼養(yǎng)的因素。目前有記錄的人工孵化個體僅為野生待產種龜在人工暫養(yǎng)時繁殖并人工孵化而來，并不能認為人工繁殖已成功。因此，研究人工飼養(yǎng)和繁殖鋸緣閉殼龜對該物種種群的保護有較大意義。

1 材料與方法

1.1 實驗安排

實驗組自2013年接收治療2只鋸緣閉殼龜指名亞種起，確定其痊愈后，擬定探尋該龜種飼養(yǎng)與繁殖方法。通過對養(yǎng)殖戶的走訪、交流，查閱相關文獻資料，儲備飼養(yǎng)相關工具、材料，設計并建設實驗場所(2014年場地建設完畢)。同年從專業(yè)養(yǎng)殖戶劉洪高處引種鋸緣閉殼龜指名亞種親龜3只，經過2014—2015年的預飼養(yǎng)，并改進、添加相關物資，2016—2017年開展正式實驗。

1.2 養(yǎng)殖環(huán)境

實驗地點位于廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h(109°36′50″～110°14′19″E，24°37′48″～25°36′39″N)，該地區(qū)為亞熱帶季風氣候，平均海拔148 m，森林覆蓋率74.8%，年平均降水量2 000 mm以上，年平均氣溫18.8 ℃(永福縣政府公開數據)。在民房內搭建養(yǎng)殖區(qū)(圖1)，選取1.5 m×4 m的室內陽臺，設長3.5 m、高2 m的通風窗(圖1：1)，朝向西南，地面采用糙面瓷磚反鋪以防止鋸緣閉殼龜指名亞種在求偶、交配、攝食等活動時滑倒。養(yǎng)殖區(qū)通風良好，日常光照強度可達10 000 Lx。設水槽4個(圖1：2)，水槽長35 cm×寬25 cm×高10 cm，以滿足鋸緣閉殼龜指名亞種飲水及涉水需求。于每年6—8月在養(yǎng)殖區(qū)加入長45 cm×寬40 cm×高10 cm的產卵盆2個(圖1：3)，底部鉆小孔透水防積，內置8 cm厚的消毒腐殖土，供產卵使用。搭設1 m×1 m及1 m×2 m的2個木質種植架(圖1：4)，架高50 cm，起遮陽等作用。在養(yǎng)殖區(qū)內陽光直射區(qū)域及非陽光直射區(qū)域各設1個測量點(圖1：5)，于每日02∶00、08∶00、14∶00、20∶00測量溫度和相對濕度，并每日清潔水槽及養(yǎng)殖區(qū)地面。

圖1 鋸緣閉殼龜指名亞種養(yǎng)殖區(qū)示意圖Fig. 1 The layout for the aquaculture area of Cuora mouhotii mouhotii

1. 通風窗， 2. 水槽， 3. 產卵盆， 4. 種植架， 5. 溫濕計

1. ventilation window， 2. water trough， 3. spawning ground， 4. arbour， 5. hygrothermograph

1.3 實驗方法

1.3.1實驗對象實驗親龜均為人工隔離飼養(yǎng)2年以上非待產鋸緣閉殼龜指名亞種，共5只(3雄2雌)(表1)。長度數據用150T型電子數顯卡尺(Meinaite公司)測量，質量數據用DT2000型電子天平(美國雙杰公司)稱量。

表1 實驗鋸緣閉殼龜個體性狀Table 1 Individual character of Cuora mouhotii mouhotii

1.3.2餌料及飼喂方式餌料盡可能符合鋸緣閉殼龜指名亞種的天然食性，借鑒相關研究(董超等，2016)，根據野生鋸緣閉殼龜指名亞種胃中尚未消化的食糜確定食物種類。2015年在廣西壯族自治區(qū)東興市調查鋸緣閉殼龜市場銷售狀況時，收集到12只已被宰殺的野生個體。

將龜體腹甲移除后打開膜，翻動左肝葉找到其下的胃；掰開龜的下頜，使用注射器從口腔注入10 mL水，把食道中的食物殘余物沖入胃中；擠壓胃部使食物殘余物下行入腸道，在賁門處和直腸末端將消化道切斷；將消化道轉至有水的燒杯中，繼續(xù)用注射器從胃的賁門處充水沖洗消化道，得到食物殘余物；在SMZ-168雙筒實體解剖鏡下鏡檢，對照圖譜、書籍(彌璽，1964；廣西植物研究所革委會，1971；范滋德，1997；張秀實， 吳征鎰，1998；中國科學院植物研究所，2002；覃海寧，2010；張巍巍，2011，2014；孫超，2014；中國科學院中國動物志委員會，2016)確定鋸緣閉殼龜指名亞種攝食的種類(表2)。

選擇特制半水龜糧(表3)，參考相關國家標準方法(國家標準化管理委員會，1994，2006，2007，2014)測定其營養(yǎng)組成。參考其胃內容物，每周添加1次鮮活餌料(新鮮水果、蘑菇及鮮活昆蟲等)進行混合投喂(鮮活餌料與龜糧的濕重比為4∶1)，并在活動區(qū)掛設墨魚骨(海螵蛸)，供其補充鈣質。養(yǎng)殖親龜每周投喂2次，繁殖期前后(6—8月)增至每周3次，投喂量以所有龜15 min內的攝食量而定，并在其攝食后及時清理，以防止餌料變質、腐敗。每次均在06∶00—07∶00定點投喂(龍再忠等，2016)。

鋸緣閉殼龜指名亞種通常在4月下旬結束冬眠，開始正常攝食，4—5月鮮活餌料投喂每周增加至2次，補充親龜營養(yǎng)、恢復親龜體能，為接下來的交配與繁殖活動做準備。每年6月下旬至8月上旬、10月下旬至次年5月上旬將雄性和雌性親龜分開飼養(yǎng)，雌性可群居而雄性單獨飼養(yǎng)，既避免雄性之間的相互爭斗造成損傷，亦可避免過度交配對雌性親龜正?；顒拥挠绊憽Ｈ囊岳蠲?2014)中的記錄為依據對鋸緣閉殼龜指名亞種交配行為及求偶行為進行判斷并記錄。

表2 鋸緣閉殼龜指名亞種消化道內容物Table 2 Food habits of Cuora mouhotii mouhotii after anatomical analysis of digestive tract

注： “+”表示在某只鋸緣閉殼龜指名亞種胃中僅出現(xiàn)1次， “++”表示在1只龜胃中出現(xiàn)2次或在2只龜胃中各出現(xiàn)1次， “+++”表示在龜胃中出現(xiàn)2次及以上

Notes： “+” indicates the species appear only once in one turtle’s stomach， “++” indicates some species appear twice or appear in 2 turtles only once， “+++” indicates some species appear in 2 turtles for twice or more

1.3.3孵化方法正式實驗開始前，親龜曾產出受精卵3枚，龜卵受精與否參考黃斌等(2004)進行判別。由于尚未準備孵化設備，因此只能在打孔的PVC盒內放入含水量5%～10%的消毒細河沙進行孵化(朱新平等，2001)。結果在孵化45 d內，全部胚胎因脫水死亡，原因為孵化過程中濕度過低，由于其為實驗準備階段所產出，缺乏各項有效統(tǒng)計，故不計入正式實驗數據。

表3 鋸緣閉殼龜指名亞種親龜餌料配方及營養(yǎng)成分Table 3 Feed formula composition and nutrient ingredient for Cuora mouhotii mouhotii

注： 以上原料比例均按常溫下(25 ℃)干制品質量進行配制

Notes： All the ingredients are prepared according to their mass at room temperature (25 ℃)

總結前期失敗的教訓，根據鋸緣閉殼龜龜卵受精率、孵化率(4.35%；Wangetal.，2011)均極其低下的特點，參考同屬于半水棲的美洲箱龜Terrapenecarolinacarolina的孵化經驗(de Vosjoli & Klingenberg，2003)進行孵化。

自然孵化組：2016年的正式實驗共收獲3枚受精卵，編號為A、B、C，均采用粒徑3～6 mm的蛭石孵化(郭撿紅等，2009)，在蛭石內放置DS1923型紐扣式自動溫濕度記錄儀(Maxim公司)測定孵化時的溫濕度，每6 h記錄1次，自然常溫孵化。

恒溫孵化組：2017年收獲的4枚受精卵，編號為D、E、F、G，在2016年的實驗基礎上添加了JCM-33A-A/M BK型溫控器(日本神港SHINKO公司)，使龜卵在28 ℃±0.2 ℃恒溫條件下孵化，且全程空氣相對濕度均維持在85%±5%(容銀燕等，2014)。

2 結果

2.1 求偶及交配行為的季節(jié)性變化

實驗觀察發(fā)現(xiàn)，雄性4月下旬便出現(xiàn)食欲減退，焦躁不安，并隨之出現(xiàn)鼻尖發(fā)紅，在水流噴濺刺激下外陰莖會伸出，此時雄性遇到雄性常出現(xiàn)相互撕咬爭斗，遇到雌性則會出現(xiàn)爬背交配的行為。雌性在交配期會出現(xiàn)運動減少，遇刺激甚至未遇刺激的情況下出現(xiàn)泄殖孔擴張的行為，并會配合雄性的求偶行為進行交配。產卵期在每年的6—7月，但在走訪中也有養(yǎng)殖戶觀察到野生待產親龜9—10月繁殖的現(xiàn)象。

2.2 溫度和天氣對交配行為的影響

實驗表明，5—6月為交配高峰期(表4)，交配次數占全年交配次數的35.16%，并出現(xiàn)雄性瘋狂追逐雌性，以及雄性之間激烈爭斗的現(xiàn)象，此時間內的日平均溫度為23.2～25.3 ℃(圖2)，但在8—10月也均觀察到種龜出現(xiàn)較頻繁的交配行為(表4)。在天氣晴朗且溫度較高(日平均溫度30 ℃以上)的條件下，表現(xiàn)較為怠惰，活動欲望較低，僅在黃昏發(fā)現(xiàn)有交配行為。而在降雨且溫度較低(日平均溫度25～30 ℃)的條件下，龜較為興奮，在正午亦發(fā)現(xiàn)有交配行為，配合人為的灑水刺激，交配行為更為頻繁。

表4 鋸緣閉殼龜指名亞種交配及雄性爭斗行為Table 4 Mating behaviors and male fight behaviors of Cuora mouhotii mouhotii

圖2 鋸緣閉殼龜指名亞種養(yǎng)殖區(qū)日平均溫度
Fig. 2 Mean daily temperature of the aquaculture area ofCuoramouhotiimouhotii

2.3 繁殖習性及體質量變化

實驗記錄表明，雌龜2次產卵之間的積溫為188 397～189 710 ℃·h。將2016年和2017年各月的親龜體質量進行對比，發(fā)現(xiàn)雌龜在每年5—6月體質量明顯上升，而在每年6—7月產卵行為出現(xiàn)時，體質量明顯降低(表5)。

在實驗過程中，雌龜產卵前15～30 d攝食量明顯增大，產卵前5～10 d食欲廢絕，產卵后1～3 d重新開始攝食。

因缺乏與鋸緣閉殼龜指名亞種人工繁殖有關的各項指標，對于其繁殖生態(tài)學的統(tǒng)計尤為困難。對多名養(yǎng)殖戶進行走訪了解后，統(tǒng)計得到鋸緣閉殼龜指名亞種人工飼養(yǎng)性成熟年限未知(缺乏人工繁殖個體)，記錄得到的生物學最小體型為443 g。

表5 2016—2017年鋸緣閉殼龜指名亞種非冬眠期體質量Table 5 The mass of Cuora mouhotii mouhotii in the non-hibernating during 2016-2017

注： 年平均增長率=(冬眠前體質量-冬眠后體質量)/冬眠后體質量×100%

Notes： Annual growth rate=(pre-hibernation mass-post-hibernation mass)/post-hibernation mass×100%

2.4 卵形態(tài)及孵化

正式實驗共收獲龜卵12枚，其中受精卵7枚，受精率58.33%(表6)，硬殼卵，長徑37.34～44.13 mm，短徑22.21～24.15 mm，卵質量14.63～15.10 g，殼厚度4.24～5.21 mm，龜卵及稚龜外觀形態(tài)等見圖3。

表6 正式實驗獲得的鋸緣閉殼龜指名亞種龜卵與孵化Table 6 The eggs and incubation of Cuora mouhotii mouhotii in formal experiment

圖3 鋸緣閉殼龜指名亞種卵及稚龜形態(tài)特點(曹鑫盛 攝)
Fig. 3 The morphological characteristics ofCuoramouhotiimouhotii’s eggs and juvenile turtle (photo by CAO Xinsheng)

a、b. 龜卵， c、d. 破殼中的稚龜， e. 1日齡稚龜， f. 交配姿勢， g. 產卵行為

a， b. egg， c， d. hatchling， e. one-day old， f. copulation posture， g. laying eggs

自然孵化組：2016年的孵化溫濕度見圖4、圖5，共收獲3枚受精卵。孵化至64 d，其中1枚龜卵正上方出現(xiàn)1條長12 mm的裂紋，并伴有少量血液滲出。根據相關研究結果(趙偉華等，2009a；郭撿紅等，2010)進行分析，原因為在胚胎發(fā)育過程中，濕度過高，胚胎增大但卵白體積未減小，導致卵殼破裂。發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象后立刻使用聚維酮碘對裂口進行消毒，后用紅霉素軟膏封住裂口，并將孵化箱濕度緩慢下降，最終該龜卵成功孵化。2016年共孵化稚龜2只(1只右側肋盾畸形)，孵化率66.67%，孵化天數分別為92 d、102 d，孵化積溫62 724 ℃·h、68 052 ℃·h(表7)。

恒溫孵化組：由于在2016年孵化過程中出現(xiàn)了龜卵開裂的現(xiàn)象，因此，2017年參考其遠源種中華條頸龜Ocadiasinensis的孵化方法(中華條頸龜與鋸緣閉殼龜野外分布有所重疊)(容銀燕等，2014)，成功孵化出3只，孵化率75.00%，孵化時間86～96 d，孵化積溫57 792～64 512 ℃·h(表7)。

圖4 自然孵化組孵化箱內日平均溫度Fig. 4 Mean daily temperature of incubator for the natural incubation group

圖5 自然孵化組孵化箱內日平均濕度Fig.5 Mean daily humidity of incubator for the natural incubation group

受精卵孵化參數自然孵化組恒溫孵化組ABCDEFG平均值變異系數/%孵化時間/d—92102—968986939.50孵化積溫/(℃·h)—62 72468 052—64 51259 80857 79262 4965.74受精卵質量/g14.7514.7714.6314.7014.9015.0015.1014.841.121日齡稚龜體質量/g—7.907.50—8.108.908.708.226.271日齡稚龜體質量與受精卵質量比/%—53.4951.26—54.3659.3357.6255.215.25

1日齡稚龜體質量為7.50～8.90 g，受精卵質量與1日齡稚龜體質量之間的關系見表7。1日齡稚龜背甲長度46.9～49.2 cm，背甲寬度34.9～36.6 cm。

3 討論

3.1 餌料選擇

人工飼養(yǎng)鋸緣閉殼龜指名亞種的食物包括各種肉類、蠕蟲、昆蟲、水果等(周婷，李丕鵬，2013)。而分布于越南的野生鋸緣閉殼龜指名亞種的主要食物為蝸牛和一些真菌類的子實體，并會在8—9月攝食成熟掉落的嶺南酸棗Allospondiaslakonensis(Fischeretal.，2010)。該研究點雖與本實驗地點氣候存在差異，不可能完全模擬，但可以參考圖2溫度變化數據，對鋸緣閉殼龜指名亞種的餌料和喂食節(jié)律或可根據實際氣候狀況和溫度變化進行調整。

從表2及崇左地區(qū)山區(qū)居民的描述了解到，鋸緣閉殼龜指名亞種在野外可能會掘食植物根莖和進食小型哺乳動物的尸體，但是目前缺乏對其攝食特性的持續(xù)性研究。因此，鋸緣閉殼龜指名亞種的具體食物種類及食物選擇是否存在地區(qū)性、季節(jié)性差異，尚有待進一步的研究探索。

3.2 龜卵大小與稚龜質量

本實驗記錄鋸緣閉殼龜指名亞種卵質量為14.63～15.10 g，與原記錄的龜卵質量(15～18 g)(周婷，李丕鵬，2013)基本相符。對朱新平等(2003)的研究進行分析，這種差異與鋸緣閉殼龜指名亞種親龜的產地種群及體型有關(趙偉華等，2009b)。其他影響因素可能還包括溫度、光照、餌料及母體營養(yǎng)狀況等(何松，2016)。

不同孵化方法孵出的1日齡稚龜體質量間變異系數僅為6.27%，較低的離散程度表明孵化方法對稚龜體質量影響較小。但由于數據過少，無法進行更多的分析，有待進一步的研究。

3.3 龜卵孵化

根據對Wang等(2011)研究結果的分析，本次實驗將鋸緣閉殼龜指名亞種卵放置于泡沫保溫箱內進行孵化，泡沫箱可避免溫度與濕度出現(xiàn)劇烈變化，這與野生個體選擇在落葉堆或沙土地等掘穴產卵的作用一致。

2016年選擇自然孵化，孵化期龜卵出現(xiàn)的破裂及該卵孵出幼龜右側肋盾畸形，或與孵化期內過高的溫度、濕度存在直接聯(lián)系(郭撿紅等，2010)，因此，2017年以28 ℃±0.2 ℃進行恒溫孵化。恒溫孵化時間較自然孵化短，2種孵化方式的孵化積溫變異系數為5.74%，孵化積溫為57 792～68 052 ℃·h，相對可信。通過走訪凌維鑫等養(yǎng)殖戶，其在南寧市曾用蛭石常溫孵化過24枚鋸緣閉殼龜指名亞種受精卵，孵化時間89～101 d，平均孵化率57.71%，與本實驗數據基本相符。本實驗與調查其他養(yǎng)殖戶記錄鋸緣閉殼龜指名亞種卵的孵化時間均長于周婷和李丕鵬(2013)60～75 d的記錄。

2016年實驗中出現(xiàn)卵殼開裂龜卵的孵化時間比另一枚長10 d，分析與卵殼開裂造成的創(chuàng)傷有關，后續(xù)實驗龜卵的孵化過程中適當降低孵化濕度可避免卵殼破裂的問題。不排除鋸緣閉殼龜指名亞種卵的孵化時間明顯受到濕度(Wynekenetal.，2007)和孵化基質pH值影響(傅麗容等，2013；李燕華等，2014)的可能性，但這些變量的影響程度尚待進一步的實驗證明。

4 小結

本實驗完整記錄了鋸緣閉殼龜指名亞種的人工飼養(yǎng)方法及交配、繁殖等生物學習性，并于全人工條件下連續(xù)2年成功繁殖、孵化出子一代個體，尚屬國內首例。隨著對鋸緣閉殼龜研究的開展，本實驗將對鋸緣閉殼龜的人工繁殖和野外種源保護提供有價值的參考，也為將來的規(guī)?；B(yǎng)殖提供理論依據。

致謝：天津農學院祖國浩老師及本科生唐一然對鋸緣閉殼龜指名亞種胃內容物辨認的幫助；校外人員盧沛侖、劉宏寶、張海、韋川源、羅升略等給予本研究在實驗場地建設、繪圖及數據測量、統(tǒng)計方面的幫助；養(yǎng)殖者劉洪高、凌維鑫、潘建洲等提供引種資源及養(yǎng)殖數據，在此一并致以誠摯的謝意。