張 玉，吳佳倫，吳曉峰，李 佳，陳 勇

(1. 彭州市環(huán)境監(jiān)測站，四川 成都 611930; 2. 成都市環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 成都 610072)

0 引 言

惡喹酸是一種喹諾酮類殺菌劑，其分子式為C13H11NO5，分子量為261.23。惡喹酸在水中的溶解度為3 μg/L。惡喹酸對真菌無活性，對革蘭陽性菌活性較弱，而對革蘭陰性菌具有廣范圍的抗菌活性，其可以在細菌的菌體內(nèi)，與對于DNA的超卷曲結(jié)構(gòu)導入反向超卷曲的酶的亞組A結(jié)合，使其機能受抑制而使DNA無法復制，從而抑制DNA的合成來阻礙病菌分裂和增殖，因此惡喹酸常被應用于防治洋蔥球莖軟腐病、水稻谷枯細菌病以及多種魚類疾病[1-3]。但是，在不規(guī)范使用的情況下，惡喹酸可能通過雨水沖洗或澆灌，淋溶進入水庫、湖泊等水體，并通過食物鏈進入人體?；诩毦鷮股啬退幮援a(chǎn)生的認識以及某些喹諾酮類抗生素，如萘啶酸，顯示的致癌、致突變、干擾生殖系統(tǒng)、誘發(fā)光過敏等毒性的認識，惡喹酸在水體中的殘留對人類及整個生態(tài)系統(tǒng)可能構(gòu)成長期潛在的威脅[4-8]。

目前關(guān)于檢測惡喹酸殘留的報道有很多，主要有高效液相色譜/熒光檢測法[9-11]、紫外分光光度法[12]、酶聯(lián)免疫吸附法[13]和高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法。其中，高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，由于具有靈敏度高、應用范圍廣、抗干擾能力強、操作方法簡便快速等優(yōu)點，而被廣泛應用于惡喹酸殘留的檢測[14-17]?；菪佬赖萚1]建立了用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜測定洋蔥中惡喹酸殘留量的快速檢測方法；丁濤[18]等使用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中殘留的19種喹諾酮類藥物；楊方等[19]用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了水產(chǎn)品中15種喹諾酮類藥物的殘留量。目前使用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法對惡喹酸的測量已涉及食品、化妝品和水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面，但對環(huán)境地表水中惡喹酸殘留的研究尚且不多[20]。由于惡喹酸在地表水中的累積可能會造成本底的增高及耐藥性的出現(xiàn)，對環(huán)境保護造成巨大的挑戰(zhàn)，因此對地表水中惡喹酸殘留進行檢測具有重要意義。

本文建立高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，對地表水中的惡喹酸殘留過濾后直接進行測量。優(yōu)化了HPLC-MS/MS條件，用多反應監(jiān)測（MRM）正離子掃描方式進行質(zhì)譜檢測，外標法定量，并對不同溶劑比例、添加劑甲酸的加入和基質(zhì)效應對惡喹酸的信號影響進行了比較。

1 實驗部分

1.1 儀器設備及試劑

Agilent 1290-6460超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國）；ACQuITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；ELGA Purelab ultra Analytical純水制備裝置（英國）。Agilent PTFE-Q（聚四氟乙烯）0.2 μm 針式過濾器。

惡喹酸標準品購于上海西隴生化科技有限公司。甲酸為HPLC級，購于上海安譜公司。甲醇為HPLC級，購于Fisher Chemical公司。實驗用水為超純水 ELGA Purelab ultra Analytical純水系統(tǒng)制備。

標準儲備溶液：稱取定量惡喹酸標準物質(zhì)，用甲醇定容至100 mL，配制成 260 mg/L的標準儲備液。然后稀釋成13 mg/L的標準中間液，于–20 ℃下避光保存。

1.2 HPLC-MS/MS條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃。

流動相：體積比為15:85的0.1%的甲酸水溶液：甲醇；流量：0.25 mL/min；進樣量：2 μL。

1.2.2 三重四級桿質(zhì)譜條件

參數(shù)優(yōu)化方式為SCAN模式和Productor ion模式，檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）正離子掃描模式；碰撞氣為高純氮氣；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量 13 L/min;霧化器壓力 60 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度 400 ℃，鞘氣流量12 L/min；毛細管電壓（正）2 000 V；噴口電壓（正）500 V。

惡喹酸質(zhì)譜分子參數(shù)見表1。

1.3 實驗步驟

將地表水過0.2 μm親水相針式過濾器，去除水樣中的雜質(zhì)后，裝入樣品瓶中。加入相應量的甲醇和惡喹酸標液，進行HPLC-MS/MS分析。

表1 惡喹酸質(zhì)譜分子參數(shù)1）

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑比例對惡喹酸響應的影響

樣品的溶劑組成比例對色譜峰影響很大，因此本實驗使用不同比例的甲醇-水溶劑配制濃度為7.8 μg/L的惡喹酸溶液，比較惡喹酸的信號響應，結(jié)果如圖1所示。其中，從1到11，甲醇比例依次為：0%、 10%、 20%、30%、40%、 50%、 60%、 70%、80%、 90%、 100%。在各比例下，惡喹酸的峰形都較好，基線平穩(wěn)，信噪比高，沒有出現(xiàn)峰分裂；但當選用60%、70%、80%、90%的甲醇作為樣品溶劑時，惡喹酸的信號響應明顯高于溶劑中甲醇比例為0%、10%、20%、30%、40%、50%、100%時。推測該現(xiàn)象可能是惡奎酸的離子化程度與溶解度綜合作用的結(jié)果：電噴霧離子化過程中，帶電液滴表面積減小，表面電荷密度增大，當電荷間靜電排斥力超過表面張力時初始液滴發(fā)生庫倫爆炸產(chǎn)生小液滴，小液滴發(fā)生崩散，逐步釋放出液滴表面多余的電荷直至釋放氣相離子，水的表面張力大，使得初始液滴大，爆炸形成小液滴困難，需要較長時間來進行溶劑蒸發(fā)，而水的揮發(fā)性低導致氣相離子釋放效率下降；此外，水的高粘度導致離子電泳遷移率低以及水的極性產(chǎn)生的溶劑化作用使得分析物呈中性而不能被檢測器識別等原因也可能導致離子化效率下降[21-23]。但惡奎酸25 ℃時在甲醇中的溶解度小于1.0%，在水中的溶解度為0.003 mg/L，因此當溶劑全部為甲醇時，可能會降低惡奎酸的溶解度，導致信號響應降低。所以在后續(xù)實驗中，將對60%、70%、80%、90%的甲醇作為溶劑進行進一步探討。

圖1 不同溶劑比例對惡喹酸響應的影響

2.2 甲酸對惡喹酸信號響應的影響

在液相色譜的流動相中加入添加劑可以改善色譜分離度，改善峰形，提高電噴霧離子化效率?；诖?，本實驗進一步探討了在樣品配制時甲酸的加入對惡喹酸響應信號的影響。分別以60%、70%、80%、90% 的甲醇作為樣品溶劑，在 2.6，52，78 μg/L 3個濃度水平下，比較加入甲酸（0.1%）與不加甲酸的區(qū)別。根據(jù)圖2中惡喹酸的出峰情況可得出，在相同甲醇比例和相同惡喹酸濃度下，加入甲酸后的響應信號明顯低于不加甲酸。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因為甲酸與惡奎酸在離子化過程中競爭液滴表面過剩電荷，產(chǎn)生了離子抑制現(xiàn)象。故在后續(xù)實驗中配制樣品時均不加入甲酸。

圖2 甲酸對惡喹酸信號響應的影響（“+”為加入甲酸；“–”為不加入甲酸）

2.3 基質(zhì)效應對直接測定惡喹酸信號響應的影響

在HPLC-MS/MS檢測中，分析物共流出組分會直接影響電噴霧的離子化效果和檢測信號的增強或抑制。為研究地表水的基質(zhì)效應對直接測定惡喹酸的影響，本實驗將超純水與地表水在甲醇比例分別為 60%、70%、80%、90%時，在 2.6，52，78 μg/L 3個濃度水平上的惡喹酸出峰情況進行對比。結(jié)果如圖3所示，在相同甲醇比例和相同濃度水平下，均基線平穩(wěn)、信噪比高、峰形一致、沒有出現(xiàn)峰分裂；當甲醇比例為60%和90%時超純水與所測兩種地表水的惡喹酸峰高存在微小差異；當甲醇比例為70%和80%時，峰高基本一致。因此，選擇甲醇比例為80%進行后續(xù)實驗。

圖3 基質(zhì)效應對惡喹酸信號響應的影響

2.4 方法性能指標

2.4.1 標準曲線及方法檢出限

在最優(yōu)條件下，加入惡喹酸標準溶液，配制成濃度為 0.13，0.52，1.04，3.9，7.8，13，26，52，78 μg/L的標準系列。以濃度為橫坐標，相對峰面積為縱坐標進行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。在 0.13～78 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.595 9x+1.378 8，線性相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 2，方法檢出限為0.036 μg/L。線性范圍內(nèi)，各濃度水平均連續(xù)進樣3次，峰面積相對標準偏差均小于4.3%。

圖4 惡喹酸標準曲線

2.4.2 回收率及相對標準偏差

取兩種地表水樣品，分別添加1.04，3.9 μg/L濃度水平的惡喹酸標準溶液。在最優(yōu)條件下，每個添加水平平行測定10次，計算其回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該方法準確性高、重現(xiàn)性好，各項指標能夠滿足殘留分析的要求。

表2 兩種地表水中惡喹酸的回收率與相對標準偏差（n=10）

2.4.3 樣品檢測

為驗證方法的實用性和準確性，應用該方法對3條河流的地表水共15個樣品進行惡喹酸含量的測定。測定結(jié)果表明，被測的15個水樣均未檢出惡喹酸殘留。

2.5 惡喹酸的檢測方法對比

目前已知的對地表水或廢水中的惡喹酸殘留進行檢測的方法中，大多需要進行固相萃取等前處理過程[24-25]。但前處理過程通常存在操作步驟繁瑣，需耗費相對較長時間；使用大量有機溶劑，可能造成環(huán)境污染；工作量大，不利于批量檢測；操作步驟多，使用試劑多，引入誤差的可能性增多，影響回收率的因素多等缺點。因此，設計一個能夠快速直接測定樣品濃度的方法很有必要。

3 結(jié)束語

惡喹酸在地表水中的累積可能會造成本底的增高及耐藥性的出現(xiàn)，對環(huán)境保護造成巨大的挑戰(zhàn)，因此對地表水中惡喹酸殘留進行檢測具有重要意義。本文建立了超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀直接測定過濾后的地表水中惡喹酸殘留的分析方法?？疾炝瞬煌軇┍壤聬亨嵝盘栱憫牟顒e，得出在一定范圍內(nèi)，甲醇比例越高，惡喹酸峰信號響應越強。比較了甲酸的加入對峰信號的影響，得出在配制樣品時加入甲酸會減小峰響應。并討論了基質(zhì)效應對惡喹酸檢測的作用。在多反應監(jiān)測正離子掃描方式下，用外標法定量，對影響回收率和重現(xiàn)性的主要因素進行優(yōu)化，在0.13～78 μg/L范圍內(nèi)進行定量分析，結(jié)果線性良好，檢出限為0.036 μg/L。該方法準確、簡單、快速、重現(xiàn)性好，適用于直接測定過濾后地表水中惡喹酸的殘留。該方法可以對環(huán)境監(jiān)測領域地表水中惡喹酸的檢測提供有用信息。接下來將對采用HPLC-MS/MS同時直接測定地表水中多種抗生素的方法進行進一步研究。