吳亞召，張文雋，雷 萍，杜 芳

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

茶樹菇(Arocybeaegirita)隸屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、糞銹傘科(Bolbitiaceae)、田頭菇屬(Agrocybe)，又名茶薪菇、油茶菇[1],其味道鮮美，脆嫩可口;含有人體所需的18種氨基酸，其中有人體不能合成的8種氨基酸，還含有豐富的B族維生素和多種礦物質(zhì)元素，長(zhǎng)期食用還具有補(bǔ)腎、潤肺、醒腦、抗衰老和降低膽固醇等功效，是一種營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值均較高的珍稀食用菌[2-3]。

食用菌在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，為滿足自身生長(zhǎng)發(fā)育的需要，往往會(huì)通過分泌胞外酶將培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解為小分子營養(yǎng)物質(zhì)，用于菌絲的吸收、轉(zhuǎn)化和利用[4-6]。這些大分子物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化過程與菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育不同階段分泌的胞外酶活性關(guān)系密切，因此了解胞外酶活性的變化規(guī)律，可以很好地了解食用菌不同生長(zhǎng)階段對(duì)營養(yǎng)的分解利用情況[7]。國內(nèi)諸多學(xué)者對(duì)栽培規(guī)模較大的食用菌營養(yǎng)生理進(jìn)行了研究，大部分研究結(jié)果表明，通過研究不同食用菌的胞外酶分泌特點(diǎn)、活性大小以及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，可以推測(cè)該食用菌在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)培養(yǎng)基中纖維素、淀粉等大分子營養(yǎng)成分的降解動(dòng)態(tài)[8-14]。但有關(guān)茶樹菇的胞外酶研究國內(nèi)尚未見報(bào)道，本研究擬以3株茶樹菇菌株為對(duì)象，分析栽培過程中菌絲生長(zhǎng)與子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育階段分泌的相關(guān)酶活性的關(guān)系，以期為了解各菌株對(duì)培養(yǎng)料中不同組分的分解利用能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

3株茶樹菇ZK08、JX09、Ag16，均為陜西省微生物研究所微生物資源中心保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基：綜合PDA培養(yǎng)基。

栽培培養(yǎng)基：棉籽殼39%，木屑30%，麩皮20%，玉米粉8%，蔗糖1.5%，石膏1.5%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))；含水量62%左右。

1.3 菌種培養(yǎng)及粗酶液的制備

菌絲生長(zhǎng)階段培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，遮光，空氣相對(duì)濕度50%～60%，母種培養(yǎng)10 d，原種35 d，栽培料培養(yǎng)50～60 d；出菇采用常規(guī)管理[15]，出兩潮菇后采收。

分別在8個(gè)階段取樣[16]，按照菌絲生長(zhǎng)半袋、滿袋、現(xiàn)蕾、出一潮菇、一潮菇子實(shí)體成熟、出二潮菇、二潮菇子實(shí)體成熟和二潮菇采收1周的發(fā)育時(shí)段采樣。分別取培養(yǎng)基上、中、下部位的培養(yǎng)料20 g，加入100 mL蒸餾水混勻，20 ℃浸泡4 h后過濾，4 000g離心5 min，取上清液即為粗酶液。

1.4 酶活性的測(cè)定

1.4.1 羧甲基纖維素(CMC)酶、淀粉酶和濾紙纖維素(FP)酶 參考Mandels等[17]和王玉萬等[18]的方法測(cè)定酶活性。CMC酶和淀粉酶：30 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)活力單位；FP酶：60 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)活力單位。

1.4.2 半纖維素酶(HC) 參考Shamala等[19]的方法測(cè)定酶活性。30 min內(nèi)催化底物生成1 mg木糖所需的酶量為一個(gè)活力單位。

1.4.3 漆酶(LAC)、多酚氧化酶和過氧化物酶 參考潘迎捷等[20]和張志良[21]的方法測(cè)定酶活性。每分鐘使OD值改變0.01所需的酶量為一個(gè)活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段羧甲基纖維素酶活性的變化

3株茶樹菇菌種ZK08、JX09和Ag16不同生長(zhǎng)階段羧甲基纖維素酶活性變化見圖1。從圖1可以看出，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中，3株茶樹菇菌種胞外羧甲基纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，但不同菌株在同一發(fā)育時(shí)期的酶活性差異較大。在菌絲生長(zhǎng)階段羧甲基纖維素酶活性均較低，增長(zhǎng)緩慢；在現(xiàn)蕾期之后酶活性迅速增加，至一潮菇子實(shí)體成熟時(shí)，酶活性達(dá)到最大值，ZK08、JX09和Ag16分別為24.83，21.64和26.57 U；在二潮菇現(xiàn)蕾至采收期間酶活性迅速降至最低，分別為6.64，4.88和8.44 U。其中以茶樹菇Ag16在栽培過程中產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶活性最大。

1.菌絲生長(zhǎng)半袋；2.滿袋；3.現(xiàn)蕾；4.出一潮菇；5.一潮菇子實(shí)體成熟；6.出二潮菇；7.二潮菇子實(shí)體成熟；8.二潮菇采收1周后。下圖同1.Hypha growing half bag；2.Full bag；3.Budding；4.First mushroom；5.Fruiting bodies mature of the first mushroom；6.Second mushroom；7.Fruiting bodies mature of the second mushroom；8.One week after picking the second mushroom.The same below圖1 3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段羧甲基纖維素酶活性的變化Fig.1 Changes of CMC enzyme activities at different growth stages

2.2 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段淀粉酶活性的變化

3株茶樹菇菌種ZK08、JX09和Ag16栽培過程中的淀粉酶活性變化見圖2。由圖2可以看出，3株菌淀粉酶活性的變化規(guī)律基本一致，在同一生長(zhǎng)階段不同菌株的酶活性有一定差異，且以ZK08產(chǎn)生的淀粉酶活性最大。在菌絲生長(zhǎng)期，淀粉酶活性增長(zhǎng)緩慢，可能是因?yàn)閷?duì)淀粉類物質(zhì)的需求不是很大，誘導(dǎo)產(chǎn)生的淀粉酶量也較少；在一潮菇幼菇形成至一潮菇子實(shí)體采收時(shí)因需要分解淀粉類物質(zhì)提供營養(yǎng)，淀粉酶活力達(dá)到最大，ZK08、JX09和Ag16分別為12.38，8.65和11.64 U；一潮菇采收后培養(yǎng)基中的淀粉類物質(zhì)被消耗，因此3株菌的淀粉酶活性均迅速減小，至二潮菇采收時(shí)，分別為3.10，2.03和2.15 U。

2.3 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段濾紙纖維素酶活性的變化

3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段濾紙纖維素酶活性變化見圖3。從圖3可以看出，茶樹菇菌種ZK08和Ag16的濾紙纖維素酶活性變化趨勢(shì)基本一致，菌絲生長(zhǎng)期酶活性不斷增大，在滿袋時(shí)達(dá)到最大，分別為13.36，14.06 U；菌絲長(zhǎng)滿至一潮菇子實(shí)體成熟期間酶活性呈下降趨勢(shì)，二潮菇幼菇形成期間酶活性有小幅上升，之后一直下降至最低，分別為4.19，6.18 U；茶樹菇菌種JX09的濾紙纖維素酶活性在菌絲生長(zhǎng)期間不斷升高，現(xiàn)蕾期最大為12.67 U，之后一直呈下降趨勢(shì)，在二潮菇子實(shí)體采收后降至最低(3.07 U)。不同菌株在同一生長(zhǎng)時(shí)期的酶活性差異較大，且以茶樹菇Ag16產(chǎn)生的濾紙纖維素酶活性最大。

圖2 3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段淀粉酶活性的變化Fig.2 Changes of amylolytic enzyme activities at different growth stages

2.4 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段半纖維素酶活性的變化

從圖4可以看出，3株茶樹菇菌種ZK08、JX09和Ag16的半纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，但3株菌在同一生長(zhǎng)階段的酶活性有一定差異性，具體表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)前期半纖維素酶活性增長(zhǎng)緩慢，隨著茶樹菇菌絲的不斷生長(zhǎng)，需要分解培養(yǎng)基中的纖維素類物質(zhì)來滿足生長(zhǎng)需求，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量半纖維素酶，因此其酶活性快速上升，至一潮菇幼菇形成時(shí)達(dá)到最大，ZK08、JX09和Ag16分別為5.63，5.17和4.93 U；在一潮菇子實(shí)體生長(zhǎng)至二潮菇子實(shí)體成熟期間，3株菌的半纖維素酶活性均迅速減小，至二潮菇采收時(shí)，分別為0.54，0.42和1.08 U?？傮w而言，在栽培過程中以ZK08產(chǎn)生的半纖維素酶活性最大。

2.5 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段漆酶活性的變化

由圖5可以看出，3株茶樹菇菌種ZK08、JX09和Ag16在栽培過程中漆酶活性變化規(guī)律基本一致，不同菌株在同一生長(zhǎng)時(shí)期的酶活性有一定差異。整個(gè)生長(zhǎng)過程中酶活性都呈下降趨勢(shì)，二潮菇子實(shí)體成熟時(shí)均降至最低，ZK08、JX09和Ag16分別為3.20，3.17和3.40 U。菌絲生長(zhǎng)半袋時(shí)3株菌的酶活性最大，分別為23.52，16.63和20.10 U。

圖4 3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段半纖維素酶活性的變化Fig.4 Changes of HC enzyme activities at different growth stages

2.6 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段多酚氧化酶活性的變化

從圖6可以看出，3株茶樹菇菌種ZK08、JX09和Ag16的多酚氧化酶活性變化規(guī)律基本一致，在同一生長(zhǎng)時(shí)期3株菌的酶活性存在一定差異性。整個(gè)栽培過程中酶活性一直呈下降趨勢(shì)，ZK08、JX09和Ag16分別從菌絲半袋時(shí)的20.32，19.87和17.34 U下降至二潮菇采收1周后的5.02，4.24和3.38 U。

2.7 茶樹菇不同生長(zhǎng)階段過氧化物酶活性的變化

從圖7可以看出，在栽培過程中茶樹菇菌種ZK08和JX09過氧化物酶活性變化規(guī)律基本一致，在整個(gè)栽培過程中酶活性一直呈下降趨勢(shì)，分別從菌絲半袋時(shí)的14.69，15.73 U降至二潮菇采收1周后的4.13，3.02 U；Ag16酶活性在菌絲生長(zhǎng)期有小幅升高，之后的變化規(guī)律同ZK08和JX09，一直呈下降趨勢(shì)，酶活性從最初的13.58 U降至二潮菇采收1周后的3.83 U。3株茶樹菇菌種在同一生長(zhǎng)時(shí)期分泌的酶活性差異不明顯。

圖6 3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段多酚氧化酶活性的變化Fig.6 Changes of polyphenol oxidase activities at different growth stages

3 討 論

食用菌胞外酶活性在其生育期內(nèi)處于動(dòng)態(tài)變化中[22-25]。本研究通過測(cè)定3株茶樹菇不同生長(zhǎng)階段羧甲基纖維素酶、淀粉酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，發(fā)現(xiàn)不同菌株在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)酶活性變化有別。

羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和半纖維素酶可以分解基質(zhì)中的纖維素、半纖維素，來滿足生長(zhǎng)、繁殖所需的營養(yǎng)。本研究中，3株茶樹菇的這3種酶在菌絲生長(zhǎng)后段都呈上升趨勢(shì)，有利于菌絲對(duì)纖維素、半纖維的降解吸收，可為子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育積累充足的碳源營養(yǎng)；在子實(shí)體不同生長(zhǎng)階段酶活性又都有不同程度上升，可能是因?yàn)榫z體生長(zhǎng)貯存的營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足子實(shí)體迅速生長(zhǎng)的需要，從而誘導(dǎo)分泌纖維素分解酶以分解利用培養(yǎng)基中的纖維素和木質(zhì)素物質(zhì)；在子實(shí)體形成后，由于培養(yǎng)基內(nèi)纖維素類物質(zhì)已被消耗，因此這3種酶活性均迅速下降。

本研究中，當(dāng)蔗糖在菌絲生長(zhǎng)階段被消耗之后，大量的淀粉酶被誘導(dǎo)產(chǎn)生，以降解淀粉類物質(zhì)，滿足菌絲生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)初期的營養(yǎng)需求。在一潮菇幼菇形成時(shí)，淀粉酶活性達(dá)到最大，此后隨著淀粉類物質(zhì)被消耗殆盡，酶活性越來越低，直至最后采收。因此，在培養(yǎng)基內(nèi)添加適量淀粉類物質(zhì)，可提高菌絲體生長(zhǎng)的活力，為生殖生長(zhǎng)積累充足的營養(yǎng)，促進(jìn)生殖發(fā)育。

漆酶、多酚氧化酶和過氧化物酶均是參與木質(zhì)素降解的3種酶類[26]。本研究中，3株茶樹菇的木質(zhì)素降解酶活性在菌絲生長(zhǎng)初期均較高，隨著菌絲的不斷生長(zhǎng)，酶活性緩慢下降，原基形成后下降趨勢(shì)明顯。這表明菌絲生長(zhǎng)階段對(duì)木質(zhì)素的降解速率較快，以提供充足的碳源滿足菌絲體生長(zhǎng)營養(yǎng)需求，并為生殖生長(zhǎng)積累充足的營養(yǎng)。木屑中含有20%以上的木質(zhì)素，對(duì)纖維素的酶解具有物理性的屏障作用，需要被優(yōu)先分解利用，之后纖維素和半纖維素才進(jìn)一步分解。所以漆酶、多酚氧化酶和過氧化物酶的高峰值比羧甲基纖維素酶、半纖維素酶來得早。

本研究中，茶樹菇胞外纖維素酶活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律可以用Chanter[27]提出的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行解釋，即在子實(shí)體發(fā)育前期，營養(yǎng)物質(zhì)被菌絲以一定速度積累，營養(yǎng)物質(zhì)積累到某個(gè)值時(shí)，便引發(fā)子實(shí)體發(fā)生；隨著子實(shí)體生物量的增加，菌絲體中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)到一定下限水平時(shí)，相應(yīng)的子實(shí)體發(fā)育就受阻停滯。這表明胞外纖維素酶和半纖維素酶與子實(shí)體發(fā)育之間存在某種內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制，但該調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。