許國棟,王長義,孔凡倩,李雯霞,胡景岑,應(yīng)秀茹,段世偉,韓麗媛*

（1.寧波大學(xué)浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國浙江寧波315211;2.深圳市南山區(qū)慢性病防治院,中國廣東深圳518054）

缺血性腦卒中是腦組織供血不足導(dǎo)致腦部缺血性損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,它具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)。腦卒中是西方國家排名第二的死亡原因,2013年全球因腦卒中死亡的人數(shù)約為640萬[1]。據(jù)WHO報(bào)道,中國缺血性腦卒中的患病率在亞太地區(qū)排名最高[2],2013年發(fā)病人數(shù)約為74萬,且從1990年到2013年增加了43.3%[3]。

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteine,HHcy）是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[4]。在我國,有75%的高血壓患者伴有HHcy。此外,高血壓與HHcy在缺血性腦卒中發(fā)病上具有協(xié)同作用。國外研究發(fā)現(xiàn)伴有HHcy的高血壓患者并發(fā)腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是單純高血壓患者的12倍[5]。胱硫醚β合成酶（cystathionine beta-synthase,CBS）是同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）代謝過程中的關(guān)鍵酶[6]。代謝關(guān)鍵酶的編碼基因發(fā)生突變是酶活性下降的重要原因。CBS活性下降可以引起血漿Hcy水平升高,甚至l成嚴(yán)重的HHcy[7,8]。甲基化是一種可遺傳的、可逆的通過甲基化修飾來調(diào)控基因表達(dá)的過程,是表觀遺傳學(xué)中研究最深入的一種機(jī)制,常發(fā)生在CpG島[9]。CpG島是基因組中富含GC（鳥嘌呤和胞嘧啶）的DNA序列,常位于多數(shù)基因的啟動(dòng)子區(qū)[10]。當(dāng)啟動(dòng)子CpG島發(fā)生異常甲基化時(shí),可影響下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,導(dǎo)致基因表達(dá)異常,引起許多相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路的阻斷,進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

目前,已有報(bào)道指出雌激素受體α基因[11]、miR-335基因[12]啟動(dòng)子高甲基化水平與缺血性腦卒中的發(fā)生相關(guān)。而且,在Ding等[13]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析中發(fā)現(xiàn),CBST833C基因多態(tài)性與腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),其中C等位基因是腦卒中的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但是,這些研究均局限于正常人群,而在高血壓人群中CBS甲基化與腦卒中的關(guān)系尚無明確報(bào)道。為此,本研究選取深圳市南山區(qū)慢性病防治所高血壓管理人群為研究對象,通過甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative methylation-specific polymerase chain reaction,qMSP）檢測CBS基因啟動(dòng)子區(qū)域目標(biāo)片段的甲基化率,分析高血壓人群中CBS甲基化與腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)聯(lián),為高血壓患者腦卒中發(fā)病預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本次病例對照研究納入來自深圳南山區(qū)社區(qū)服務(wù)中心高血壓管理系統(tǒng)的243名高血壓患者（設(shè)為高血壓組）和132名高血壓并發(fā)缺血性腦卒中患者（以下簡稱腦卒中患者,設(shè)為腦卒中組）。所有參與者均滿足在深圳居住滿6個(gè)月,且已納入高血壓管理系統(tǒng)管理的要求。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)為舒張壓≥140 mmHg或/和收縮壓≥90 mmHg,或自我報(bào)告有高血壓服藥史。腦卒中診斷首先通過問卷調(diào)查掌握患病史,對患有腦卒中的患者,邀請2名腦血管專家對其進(jìn)行臨床評(píng)估和神經(jīng)影像學(xué)（CT或MRI）評(píng)定,主要按照內(nèi)科學(xué)第7版教材的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定。排除標(biāo)準(zhǔn)為:1）患有繼發(fā)性高血壓、癌癥、嚴(yán)重肝腎疾病者;2）妊娠者;3）服用葉酸或維生素B6或B12的患者。所有受試者自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

由受過訓(xùn)練的醫(yī)生或護(hù)士對調(diào)查對象進(jìn)行問卷調(diào)查、體格檢查和生化指標(biāo)檢測。問卷內(nèi)容主要包括年齡、性別、吸煙和飲酒情況、用藥史等;體格檢查包括調(diào)查對象的靜坐血壓、身高、體重、腰圍（waist circumference,WC）和臀圍（hip circumference,HC）;生化指標(biāo)包括Hcy、尿酸（uric acid,UA）、甘油三酯（triglyceride,TG）、總膽固醇（total choles terol,TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和空腹血糖（blood glucose,Glu）。

1.3 DNA甲基化水平檢測

研究對象在空腹12 h后,用EDTA抗凝管抽取5 mL靜脈血,置于低溫采樣箱后立即移送實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行后續(xù)研究或保存在-80℃超低溫冰箱。血液DNA的提取通過Lab-Aid 820核酸提取儀（廈門致善生物科技股份有限公司）及配套的試劑盒進(jìn)行,DNA濃度和純度測量采用NanoDrop 1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Corporation,USA）。DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化r采用EZ DNA Methylation-Gold Kit甲基化試劑盒（Zymo Research Corporation,USA）,并嚴(yán)格按照說明書操作。CBS甲基化水平的檢測采用qMSP[14]。反應(yīng)體系為1.5μL亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA、0.5μL的正向引物、0.5μL的反向引物、10μL Zymo TaqTM PreMix和7.5μL DNAase/RNAase-free water,具體引物設(shè)計(jì)見表1。PCR擴(kuò)增的條件為95℃預(yù)變性10 min;95℃變性解鏈20 s,56℃退火45 s,72℃延伸20 s,共45個(gè)循環(huán);40℃延伸5 min,于4℃保存。待測樣本的DNA序列完成PCR擴(kuò)增后,采用Qsep100 DNA分析儀（BiOptic Inc.,China）進(jìn)行甲基化水平檢測。甲基化百分率（percent of methylated reference,PMR）被用來對甲基化率進(jìn)行指標(biāo)量化[14]。PMR由Ct值轉(zhuǎn)化而得,計(jì)算公式為:PMR=2-（Ct樣本-Ct內(nèi)參）×100%[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組計(jì)量資料間的比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。不同分位CBS甲基化率與腦卒中關(guān)系研究中,將CBS甲基化率第一分位數(shù)Q1、第二分位數(shù)Q2和第三分位數(shù)Q3相應(yīng)區(qū)間分別賦值為1、2、3,采用多元二分類logistic回歸分析模型校正混S因素后,分析CBS基因的甲基化水平與腦卒中的關(guān)系。同時(shí)將CBS甲基化率作為連續(xù)型變量納入模型,計(jì)算CBS甲基化率每增加5%的OR（odds ratio）。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線來估計(jì)CBS甲基化率預(yù)測腦卒中發(fā)病的效果。

2 結(jié)果

2.1 基線資料

與高血壓組相比,腦卒中組在年齡、性別、UA、TC、TG、體質(zhì)指數(shù)（body mass index,BMI）、LDL、Glu、WC、HC、收縮壓（systolic blood pressure,SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure,DBP）和吸煙狀態(tài)等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。但是,兩組中飲酒和服用降壓藥的狀態(tài)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,而且腦卒中組的Hcy為21.13±18.56μmol/L,顯著高于高血壓組的16.97±12.89μmol/L（P=0.01）,相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

2.2 DNA甲基化組間比較

啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化對基因的表達(dá)具有重要影響,我們首先通過UCSC Genome Bioinformatics（http://genome.ucsc.edu/）查找CBS啟動(dòng)子區(qū)域是否存在CpG島,結(jié)果顯示CBS基因啟動(dòng)子目標(biāo)片段位于Human GRCH37/hg9,chr21:44 497 096～44 497 188（圖1）。為研究CBS啟動(dòng)子甲基化在高血壓組與腦卒中組中是否存在差異,我們對兩組中CBS基因啟動(dòng)子片段甲基化率進(jìn)行了t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示腦卒中組CBS甲基化率為38.05%,低于高血壓組的50.61%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01,表2）。此外,CBS甲基化率在男性腦卒中患者為32.18%,低于男性高血壓患者中的47.70%（P<0.01）,而在女性腦卒中患者與高血壓患者中CBS甲基化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.08）,結(jié)果見圖2。

2.3 DNA甲基化與腦卒中關(guān)系

為進(jìn)一步研究高血壓人群中CBS啟動(dòng)子甲基化與腦卒中的關(guān)系,我們進(jìn)行了二分類logistic回歸分析。結(jié)果如表3顯示,在Model 1模型校正年齡、性別、BMI、Hcy、UA、TC、TG、LDL、Glu、腰圍、臀圍、SBP、DBP、吸煙、飲酒、抗高血壓藥物后,與CBS甲基化最低三分位數(shù)（Q1）相比,最高三分位數(shù)（Q3）與腦卒中的OR（95%CI）為0.26（0.14～0.47）,其中男性為0.14（0.06～0.36）,女性為0.48（0.19～1.20）,這種關(guān)聯(lián)只在男性中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在校正Model 1后,CBS甲基化率每增加5%對腦卒中的OR（95%CI）為0.91（0.86～0.95）,其中男性為0.87（0.81～0.93）,女性為0.93（0.86～0.99）。在男性Crude和Model 1模型中,不同CBS甲基化率分位數(shù)對腦卒中的P-trend均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,在高同型半胱氨酸組和低同型半胱氨酸組中CBS甲基化率每增加5%對腦卒中的OR（95%CI）分別為 0.88（0.82～0.94）和 0.93（0.87～0.99）。

表1 qMSP引物序列Table 1 Primers used for qMSP analysis

Item Age（years）Gender（M/W）Hcy（μmol/L）UA（μmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）BMI（kg/m2）LDL（mmol/L）Glu（mmol/L）WC（cm）HC（cm）SBP（mmHg）DBP（mmHg）Smoking（No/Yes）Drin11.27 115/17 112/20 13/110 0.01-2.54-0.14 0.90 1.77-0.17 1.63 0.19-0.08 0.58-0.71-0.14 0.07 7.41 7.04 4.55 P 0.69 0.96 0.01 0.89 0.39 0.08 0.87 0.10 0.85 0.94 0.56 0.48 0.89 0.79<0.01<0.01<0.01

圖1 CBS啟動(dòng)子區(qū)域目的片段Fig.1 The characteristics of target sequences in CBS gene promoter

2.4 ROC曲線分析

采用ROC曲線分析來評(píng)估CBS啟動(dòng)子甲基化率對高血壓患者并發(fā)腦卒中的預(yù)測效果。ROC曲線下面積（area under the curve,AUC）的計(jì)算結(jié)果如圖3所示,總?cè)巳褐蠧BS啟動(dòng)子甲基化率與腦卒中的AUC為0.64,95%CI為0.58～0.70（P=0.03）,男性中CBS啟動(dòng)子甲基化率與腦卒中的AUC值為0.69,95%CI為0.62～0.76（P<0.01）,女性CBS啟動(dòng)子甲基化率與腦卒中的AUC值為0.58,95%CI為 0.49～0.67（P=0.10）。

表3 CBS啟動(dòng)子甲基化水平與腦卒中關(guān)聯(lián)的多因素logistic回歸分析Table 3 Multivariable logistic regression analysis of association between CBS methylation and the risk of stroke

圖3 高血壓患者中CBS甲基化與腦卒中的ROC曲線Fig.3 The ROC curve of CBS methylation and stroke in hypertensive patients

3 討論

啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化調(diào)控是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要方式之一,高甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá),低甲基化會(huì)促進(jìn)基因表達(dá)[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CBS啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。甄Ⅰ潔等[15]在研究哈薩克族CBS甲基化水平與食管癌相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn),食管癌患者CBS甲基化率高于非食管癌患者。涂小煌等[16]發(fā)現(xiàn)CBS基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化組人群中CBSmRNA水平低于低甲基化組,且在結(jié)直腸癌患者中CBS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著高于正常對照組。CBS是Hcy代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,在維生素B6的催化下,能使Hcy與絲氨酸縮合成胱硫酸[17],而CBS酶的缺失,會(huì)導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)的聚積。本研究選取單純高血壓患者和高血壓并發(fā)腦卒中患者,以探討高血壓患者中CBS啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與腦卒中之間的關(guān)聯(lián)。在對比了高血壓患者和高血壓并發(fā)腦卒中患者Hcy和CBS甲基化率水平后發(fā)現(xiàn),腦卒中組CBS甲基化水平顯著低于高血壓組,但Hcy水平在腦卒中組要高于高血壓組。降文蘭等[17]的研究發(fā)現(xiàn)CBS相對表達(dá)量在正常對照組中高于腦卒中組,腦卒中組CBS基因應(yīng)該處于高甲基化狀態(tài),與本研究結(jié)果不一致。可能原因是本研究的對照人群是高血壓患者,高血壓CBS基因表達(dá)水平高于正常人群。此外,Hcy濃度也會(huì)對甲基化水平產(chǎn)生影響。Cacciapuoti[18]研究發(fā)現(xiàn)Hcy濃度與基因組DNA甲基化程度呈負(fù)相關(guān),Hcy可通過影響基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平發(fā)揮生物學(xué)作用,進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。高濃度Hcy可通過抑制S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosine homocysteine,SAH）的代謝,來促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)基因甲基化程度降低[19]。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾在性別上存在差異,兩組甲基化率只有在男性中才存在差異,且CBS甲基化與腦卒中關(guān)聯(lián)只在男性中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種性別差異在相關(guān)研究中也有報(bào)道。Lin等[20]發(fā)現(xiàn)LINE-1基因的高甲基化增加男性缺血性腦卒中患病的風(fēng)險(xiǎn)。早期研究也發(fā)現(xiàn),在C57BL/6J雄性小鼠中CBS酶的表達(dá)高于雌性小鼠[21]。我們推測這種性別差異的甲基化修飾現(xiàn)象可能與雄激素相關(guān),有研究證明在雌性老鼠中注射雄激素會(huì)兩倍激活腎臟中CBS酶的表達(dá)[22]。然而這種性別差異的具體機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)我們的結(jié)論。

需要指出的是,本研究的基線資料顯示,高血壓組和腦卒中組在飲酒和服用降壓藥狀態(tài)上存在差異,其中高血壓組飲酒率和服用降壓藥率均顯著高于腦卒中組。根據(jù)本課題組之前針對高血壓患者同型半胱氨酸流行狀況及影響因素分析的研究[23],在調(diào)整年齡、性別因素后,服用降血壓藥組的同型半胱氨酸水平為13.66 mmol/L,與未服用降血壓藥組的13.23 mmol/L無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;飲酒組的同型半胱氨酸水平為13.67 mmol/L,與未飲酒組的13.54 mmol/L之間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究高血壓組和腦卒中組所選人群在年齡、性別上是匹配的,故我們可以認(rèn)為在本研究的人群中服用高血壓藥物和飲酒對于同型半胱氨酸水平無影響。而且,我們在后續(xù)研究CBS基因啟動(dòng)子甲基化與腦卒中關(guān)系時(shí)也均校正了飲酒、服用降壓藥等相關(guān)因素。

綜上所述,男性高血壓患者中CBS基因啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化與腦卒中的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),可以作為一個(gè)有效的腦卒中早期診斷分子標(biāo)志物。