翁新憲,周 轉(zhuǎn),張治寶,2,廖朝亮,楊力芳*

（1.中南大學(xué)腫瘤研究所,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410078;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410008）

外泌體（exosome）是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的胞外膜性囊泡,直徑范圍30～200 nm,電鏡下呈現(xiàn)杯托樣結(jié)構(gòu)[1,2]。近年來(lái)的研究表明,腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞不僅可以通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸或釋放可溶性細(xì)胞因子的方式發(fā)揮功能,還可以通過(guò)分泌外泌體實(shí)現(xiàn)與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞之間的聯(lián)系,介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。外泌體載有特異性生物學(xué)物質(zhì),其中脂質(zhì)成分包含有鞘脂、膽固醇、神經(jīng)酰胺以及花生四烯酸和前列腺素等信號(hào)分子;常見(jiàn)的蛋白質(zhì)包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白（GTP酶,膜聯(lián)蛋白,flotillin）、四跨膜蛋白（CD9,CD63,CD81,CD82）、伴侶分子（Hsp70,Hsp90）、多囊內(nèi)體合成蛋白（Alix,TSG101）、細(xì)胞骨架蛋白（Actin,Tubulin）和脂質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì);此外,還涉及DNA、mRNA、microRNA、中間代謝產(chǎn)物等。這些物質(zhì)不僅能反映其來(lái)源細(xì)胞類(lèi)型,更重要的是,還與其來(lái)源細(xì)胞的生理功能或病理改變密切相關(guān)。外泌體與受體細(xì)胞融合,傳遞信息分子,誘發(fā)相關(guān)的信號(hào)通路,執(zhí)行多種重要的生物學(xué)功能[3,4]。外泌體不僅具有細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信息傳遞的生理功能,還具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展、免疫逃≥、血管生成、藥物及放射抵抗等功能[5]。本文著重探究外泌體的形成、分泌機(jī)制及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的進(jìn)展。

1 外泌體形成機(jī)制

1.1 外泌體的形成

目前,對(duì)外泌體形成的機(jī)制已有比較充分的認(rèn)識(shí)。首先,胞膜通過(guò)內(nèi)吞作用形成小囊泡即內(nèi)吞室,內(nèi)吞室相互融合形成早期內(nèi)體（early endosome,EE）并進(jìn)入內(nèi)體循環(huán)。隨后,早期內(nèi)體進(jìn)一步成熟,轉(zhuǎn)化為晚期內(nèi)體（late endosome,LE）,此時(shí),內(nèi)體膜返褶逆出芽形成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicle,ILV）[6,7]。富含ILV的內(nèi)體稱(chēng)為多囊內(nèi)體（multivesicular body,MVB）。含有 CD63、LAMP1、LAMP2以及晚期內(nèi)體標(biāo)志的MVB與細(xì)胞質(zhì)膜融合,釋放其內(nèi)ILV至胞外,形成外泌體[8,9]（圖1）。外泌體形成機(jī)制主要有內(nèi)體運(yùn)輸分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）依賴(lài)和ESCRT非依賴(lài)兩種形式（圖2）。

圖1 外泌體形成與分泌過(guò)程PM:細(xì)胞膜;ILV:腔內(nèi)囊泡;MVB:多囊內(nèi)體。Fig.1 Exosome biogenesis and secretionPM:Plasma membrane;ILV:Intraluminal vesicle;MVB:Mul-tivesicular body.

1.2 ESCRT依賴(lài)的形成機(jī)制

外泌體形成過(guò)程中ESCRT募集泛素化的蛋白質(zhì)到質(zhì)膜上,促使MVB釋放其內(nèi)ILV至胞外。ESCRT在外泌體形成過(guò)程中的功能最初是從蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中提出[10]。ESCRT包含4種復(fù)合體及相關(guān)輔助蛋白質(zhì),ESCRT-0識(shí)別并募集大多數(shù)蛋白質(zhì),ESCRT-Ⅰ和ESCRT-域誘導(dǎo)出芽,ESCRT-Ⅲ促使囊泡分離,而輔助蛋白質(zhì)（VTA1、ALIX、VPS4等）尤其是VPS4,r促使ESCRT之間發(fā)生不斷分離和再結(jié)合的循環(huán)過(guò)程。這些物質(zhì)在外泌體形成的過(guò)程中各顯其能[11]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),ESCRT-0的成員Hrs（hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate）能識(shí)別被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì),并與ESCRT-0的另一組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)配適分子（signal transducing adaptor molecule,STAM）相互作用。抑制Hrs表達(dá)[12～14],或者敲除STAM1[15],均能使外泌體的形成減少。此外,ESCRT-Ⅰ成員腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101,TSG101）的缺失也能使外泌體的形成量減少[16]。人們?cè)谌橄侔┲邪l(fā)現(xiàn),ESCRT-Ⅲ成員CHMP4的缺失會(huì)使外泌體的形成減少[17]。這些研究充分說(shuō)明了ESCRT在外泌體形成中的關(guān)鍵作用。

有研究報(bào)道,輔助蛋白質(zhì)ALIX可促進(jìn)內(nèi)體出芽形成腔內(nèi)囊泡從而增加外泌體的形成量[17]。但在HeLa-CIITA細(xì)胞中,敲除ALIX能夠增加MHC class域在胞質(zhì)中的積累,對(duì)外泌體的形成沒(méi)有影響[15]。VPS4參與腔內(nèi)囊泡形成的最后一步,促使膜或ESCRT-Ⅲ復(fù)合體的分離[18]。在HeLa-CIITA細(xì)胞中抑制VPS4B的功能可使外泌體的形成增多[15],然而,在乳腺癌細(xì)胞中同時(shí)沉默VPS4A和VPS4B之后exosome的形成增加,沉默VPS4A、VPS4B兩者中任何一個(gè),對(duì)exosome的形成沒(méi)有太大影響[17]。在RPE1細(xì)胞中同時(shí)抑制VPS4A、VPS4B能抑制exosome的分泌[16]。這些研究提示以不同細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ推渫饷隗w生成存在異質(zhì)性。

1.3 ESCRT非依賴(lài)的形成機(jī)制

近年來(lái),研究者發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的ESCRT依賴(lài)機(jī)制,細(xì)胞還可以通過(guò)ESCRT非依賴(lài)機(jī)制輔助生成ILV及MVB,包括脂質(zhì)、四跨膜蛋白家族分子或熱休克蛋白（heat-shock protein,HSP）。Trajkovic等[19]首次證實(shí)了外泌體形成的ESCRT非依賴(lài)機(jī)制。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭星媒礒SCRT,發(fā)現(xiàn)含有脂質(zhì)蛋白（proteolipid protein,PLP）的外泌體能正常形成。中性鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase,nSMase）水解鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺（ceramide）,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制該酶的作用可減少神經(jīng)酰胺的生成,進(jìn)而降低MVB膜的內(nèi)向生芽作用,減少外泌體的形成,提示神經(jīng)酰胺以不依賴(lài)ESCRT的作用而形成外泌體。Kosakan和Chairoungdua團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用nSMase抑制劑GW4869作用于HEK293細(xì)胞可減少內(nèi)含PLP外泌體的分泌,其過(guò)程不依賴(lài)于ESCRT,而需要神經(jīng)酰胺的合成[20,21]。膽固醇是MVB的一個(gè)重要組成成分[22],同時(shí)也富含于外泌體外膜[23]。在少突膠質(zhì)細(xì)胞中,通過(guò)藥物或基因誘導(dǎo)膽固醇在晚期MVB中累積,能促進(jìn)包含flotillin-2、ALIX、CD63和膽固醇的外泌體分泌,這個(gè)過(guò)程依賴(lài)于flotillin-2[24]。磷脂酶D2（phospholipases D2,PLD2）能將磷脂酰膽堿水解成磷脂酸,研究報(bào)道外泌體的形成需要PLD2的參與[25,26]。

研究發(fā)現(xiàn),四跨膜蛋白家族與外泌體內(nèi)含物的分選有關(guān)。人們應(yīng)用nSMase抑制劑GW4869作用腫瘤細(xì)胞系,觀察到多種典型的外泌體蛋白質(zhì)（CD63、CD81 或 TSG101）和 miRNA 的分泌減少[12,27]。在人黑色素瘤細(xì)胞中,CD63能分選黑色素蛋白使其進(jìn)入ILV,這個(gè)過(guò)程既不依賴(lài)神經(jīng)酰胺途徑也不依賴(lài) ESCRT 途徑[28]。TSPAN8[29]和 CD81[30]也可分選一系列配體等進(jìn)入外泌體。在HEK293細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)CD9或CD82能促進(jìn)外泌體形成[21]。

此外,分子伴侶HSP70可募集轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor,TFR）到外泌體中[31],并結(jié)合胞漿蛋白KFERQ,進(jìn)一步將胞漿蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到ILV[32]。

以上信息提示,外泌體形成與ESCRT非依賴(lài)機(jī)制的關(guān)系是生命科學(xué)的熱點(diǎn)之一,隨著研究的深入,ESCRT非依賴(lài)機(jī)制輔助生成外泌體還需更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)充分證實(shí)其功能效應(yīng)。

2 外泌體的分泌調(diào)節(jié)

除了外泌體形成的調(diào)控機(jī)制外,外泌體分泌的調(diào)節(jié)也是一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)形成MVBs后,不同亞群的MVBs有不同的降解途徑,分泌型MVB與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放外泌體;降解型MVB與溶酶體融合,導(dǎo)致MVB及其內(nèi)含物降解[8]。近年來(lái),對(duì)外泌體分泌至胞外過(guò)程的研究逐漸增多,其主要依賴(lài)Rab家族[33]和SNARE家族的協(xié)助作用（圖2）。

2.1 Rab家族與外泌體分泌

Rab蛋白是存在于質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中的一類(lèi)調(diào)節(jié)型的小分子,是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶（GTPase）結(jié)合蛋白R(shí)as超家族中最大的亞家族,能調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的不同階段,比如囊泡的出芽、囊泡和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、囊泡的銜接,從而促進(jìn)膜的融合。Rab蛋白作為胞內(nèi)的運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì),在調(diào)控胞吞和胞吐過(guò)程中發(fā)揮重要作用[34]。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)外泌體中含有Rab家族蛋白[10]。第一個(gè)報(bào)道與外泌體分泌相關(guān)的Rab蛋白是Rab11,在白血病研究中發(fā)現(xiàn),Rab11能調(diào)控外泌體分泌[35],過(guò)表達(dá)Rab11突變質(zhì)粒,外泌體分泌減少[36]。在中性粒細(xì)胞[37]和原代少突膠質(zhì)細(xì)胞[38]中,人們發(fā)現(xiàn)抑制Rab35的表達(dá)能減少外泌體分泌。后續(xù)在人RPE1細(xì)胞中也證實(shí)外泌體分泌需要Rab11或Rab35的參與[16]。在HeLa細(xì)胞中,沉默 Rab2B、Rab5A、Rab9A、Rab27A、Rab27B均能減少外泌體分泌,其中Rab27A和Rab27B的缺失減少效應(yīng)更明顯,而Rab11A或Rab7的缺失對(duì)外泌體分泌無(wú)影響[39]。但是在MCF-7細(xì)胞中,包含同線蛋白和ALIX的外泌體分泌卻需要Rab7 的參與[17]。在黑色素瘤[40]、乳腺癌[41]中沉默Rab27A,外泌體分泌減少。而在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中,Rab27A的缺失并不會(huì)減少外泌體分泌,但是同時(shí)敲除Rab27A和Rab27B會(huì)減少外泌體分泌[42]。大量研究證實(shí)Rab家族在外泌體膜融合過(guò)程中起重要作用,這為后續(xù)探索外泌體分泌的研究者們提供了思路。

2.2 SNARE家族與外泌體分泌

可溶性NSF附著蛋白受體（soluble NSF-attachment protein receptor,SNARE）家族是外泌體分泌中另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子,是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體。兩個(gè)負(fù)載不同成分的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)對(duì)接之后,SNARE有助于脂質(zhì)雙分子層融合[43]。在不同類(lèi)型的細(xì)胞中,SNARE蛋白SNAP-23、VAMP-7和VAMP-8參與鈣離子調(diào)控的溶酶體分泌物與細(xì)胞膜的融合[44～46]。在HEK293細(xì)胞中,SNARE蛋白復(fù)合體中的Ykt6促進(jìn)裝載成形素WNT3A的外泌體分泌[13]。在果蠅MVB中,人們也檢測(cè)到Y(jié)kt6蛋白的存在[47]。研究報(bào)道,突觸融合蛋白1A（syntaxin 1A,STX1A）也能作用于外泌體分泌機(jī)制[48]。由于SNARE介導(dǎo)細(xì)胞器膜融合的異質(zhì)性,其作用還需在多個(gè)模型中驗(yàn)證。

2.3 其他

Hyenne等[49]在秀麗隱桿線蟲(chóng)和乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),Ral-1（Ras-related GTPase）定位于MVB膜表面,與MVB的形成、MVB和細(xì)胞膜的融合有關(guān)。該課題組還發(fā)現(xiàn)Ral-1的下游蛋白質(zhì)——突觸融合蛋白5（syntaxin 5,STX5）在MVB膜與細(xì)胞膜融合的過(guò)程中也同樣發(fā)揮重要的作用,敲除STX5之后,MVB外膜不再與細(xì)胞膜融合,使得MVB在細(xì)胞內(nèi)累積,與此同時(shí),該過(guò)程需要RalA、RalB的參與。Yang等[50]在MCF-7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),Rab3D能促進(jìn)外泌體分泌。在T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)甘油二酯激酶α（diacylglycerol kinaseα,DGKα）能抑制外泌體分泌,而遏阻DGKα的表達(dá)r能促進(jìn)外泌體分泌[51],提示DGKα是MVB形成的負(fù)調(diào)控因子?？傊?細(xì)胞中可能還存在許多效應(yīng)分子與外泌體分泌調(diào)控有關(guān),更深入探討跨膜分泌、細(xì)胞外分泌等途徑機(jī)制,將有助于對(duì)外泌體的全面認(rèn)識(shí)。

3 受體細(xì)胞攝取外泌體的機(jī)制

外泌體形成分泌至胞外后被受體細(xì)胞攝取的過(guò)程也涉及到多種調(diào)節(jié)機(jī)制。外泌體表面分子與受體細(xì)胞質(zhì)膜表面分子特異性結(jié)合介導(dǎo)了其與受體細(xì)胞的融合。研究證明,連接蛋白如整合素蛋白、細(xì)胞黏附分子能調(diào)控外泌體與受體細(xì)胞膜融合。比如:樹(shù)突狀細(xì)胞膜上LFA-1分子可與外泌體表面的ICAM-1特異結(jié)合[52],腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體表面表達(dá)的TSPAN8可與內(nèi)皮細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞的ICAM-1結(jié)合[52],受體細(xì)胞表面CD169可與外泌體中高水平配體α2,3連接的唾液酸結(jié)合[53],腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體所表達(dá)的硫酸肝素糖蛋白可被受體細(xì)胞識(shí)別[54],巨噬細(xì)胞膜上的半凝素-5可識(shí)別紅細(xì)胞來(lái)源的外泌體[55]。此外,受體細(xì)胞內(nèi)化外泌體同樣需要眾多分子參與。研究發(fā)現(xiàn),受體細(xì)胞內(nèi)化外泌體通過(guò)dynamin、PI3-kinase和actin聚合3種方式進(jìn)行[38,56]。外泌體是細(xì)胞間重要的交流方式之一,在受體細(xì)胞攝取外泌體的機(jī)制研究中,除了通過(guò)分子間特異性結(jié)合介導(dǎo)的外泌體攝取外,更多其他作用方式還有待進(jìn)一步的探索。

4 外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

4.1 外泌體影響腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

近年來(lái),大量研究發(fā)現(xiàn)外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)不同的內(nèi)含物調(diào)控受體腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。黑色素瘤相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),高侵襲性的黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)外泌體分泌MET蛋白使骨髓祖細(xì)胞向表達(dá)c-Kit、Tie2和Met的表型轉(zhuǎn)化,并促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移前龕的形成,從而增加黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[57]。鼻咽癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),LMP1陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞與陰性的細(xì)胞相比能夠產(chǎn)生更多的外泌體,轉(zhuǎn)運(yùn)HIF1α蛋白至受體細(xì)胞,從而將高侵襲性的特性轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞,促進(jìn)鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移[58]。KRAS是重要的致瘤蛋白[59],近期研究發(fā)現(xiàn),大腸癌細(xì)胞可以通過(guò)外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)KRAS蛋白,從而加速受體細(xì)胞增殖[60]。外泌體外膜蛋白參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移傾向性。比如:乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體中富含整合素α6β4、α6β1 和αvβ5,分別作用于基質(zhì)細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞和肝臟庫(kù)普佛細(xì)胞,可促進(jìn)Src活化和促炎癥S100基因表達(dá),從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的肺和肝臟的傾向性轉(zhuǎn)移[61]。

外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)RNA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞攝取星型角質(zhì)細(xì)胞,分泌含有PTEN-targeted-miRNAs的外泌體,促使PTEN表達(dá)下降,繼而引起CCL2分泌升高,CCL2招募IBA1型骨髓細(xì)胞,后者能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡,最終促使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生腦轉(zhuǎn)移[62]。研究證明外泌體不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)成熟的miRNA還可以促進(jìn)miRNA成熟,乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體具有自主促進(jìn)前體miRNA成熟的能力,刺激周?chē)侵铝鲂陨掀ぜ?xì)胞形成腫瘤[63]。此外,外泌體也可轉(zhuǎn)運(yùn)lncRNA,肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體分泌攜帶lncTUC339轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞,促進(jìn)周?chē)荏w細(xì)胞增殖、克隆形成等,進(jìn)而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[64]。HeLa和MCF-7細(xì)胞分泌的外泌體富含有l(wèi)ncRNA（MALAT1、HOTHAI和GAS5）,它們作用于受體細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)其腫瘤表型[65,66]。

外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。腫瘤成纖維細(xì)胞是大多數(shù)實(shí)體腫瘤微環(huán)境中主要的細(xì)胞成分,前列腺癌研究發(fā)現(xiàn),病人組織來(lái)源的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的外泌體可以引起受體腫瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重編程,抑制腫瘤細(xì)胞線粒體氧化磷酸化而促進(jìn)糖酵解和谷氨酰胺依賴(lài)性還原羧化。進(jìn)一步通過(guò)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、脂質(zhì)、三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物至受體腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)其在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下的生長(zhǎng)[67～69]。這些研究明確了外泌體在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移中的作用。不斷發(fā)現(xiàn)新的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)含物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用與分子機(jī)制,是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。

4.2 外泌體參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體具有影響免疫系統(tǒng)從而促進(jìn)腫瘤演進(jìn)的作用。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體富含CD95L、TRAIL和galectin9等分子,這些分子被受體T細(xì)胞攝取后,導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)生凋亡[70]。此外,腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可影響抗原提呈細(xì)胞的功能,腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體富含PGE2、TGFβ、HSP72和miRNA等成分,被單核細(xì)胞攝取后,可以誘導(dǎo)其向骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞（myeloidderived suppressor cells,MDSCs）表型轉(zhuǎn)化[71]。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以阻斷樹(shù)突細(xì)胞（dendritic cell,DC）的成熟,該效應(yīng)是通過(guò)TGF-β途徑實(shí)現(xiàn)的[72]。肺癌的相關(guān)研究報(bào)道,巨噬細(xì)胞攝取肺癌細(xì)胞分泌的含有miRNA的外泌體,靶向結(jié)合Toll樣受體mRNA并使其降解,從而減少Toll樣受體的表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎癥因子,最終導(dǎo)致腫瘤的全身轉(zhuǎn)移[53]。大腸癌細(xì)胞分泌的外泌體中含有誘導(dǎo)凋亡、壞死的Fas蛋白,可以誘導(dǎo)受體T細(xì)胞發(fā)生凋亡[73]。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)EGFR至巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞抑制表型,具體機(jī)制是EGFR激活MEKK2,繼而磷酸化IRF3抑制IFN-Ⅰ產(chǎn)生,最終使得巨噬細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答減弱[74]。這些研究以外泌體為切入點(diǎn),為深入探討腫瘤免疫和逃≥機(jī)制開(kāi)創(chuàng)了新的視角。

4.3 外泌體參與腫瘤藥物抵抗

腫瘤藥物治療特別是靶向個(gè)體化治療是目前腫瘤治療的新手段,而了解腫瘤藥物抵抗r是提高治療療效的關(guān)鍵問(wèn)題之一。近年來(lái),隨著外泌體研究進(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)外泌體參與了腫瘤藥物治療抵抗。外泌體介導(dǎo)發(fā)生藥物抵抗的機(jī)制主要分為3種（圖3）:第一種是腫瘤細(xì)胞通過(guò)外泌體介導(dǎo)藥物排出,從而降低胞內(nèi)藥物濃度,誘發(fā)藥物抵抗。如:卵巢癌的藥物抵抗研究發(fā)現(xiàn),順鉑抵抗的卵巢癌細(xì)胞與敏感細(xì)胞相比,外泌體的分泌量提升2.6倍,并且富含順鉑,這提示順鉑抵抗的卵巢癌細(xì)胞利用外泌體向胞外排除藥物[75]。前列腺癌細(xì)胞對(duì)docetaxel的抵抗機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)多藥抵抗蛋白（MDR-1）至敏感腫瘤細(xì)胞,而MDR-1分子可以將藥物泵至胞外,從而發(fā)揮藥物抵抗作用[76,77]。除了抵抗細(xì)胞來(lái)源的外泌體,腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體也可作用于大腸癌細(xì)胞,通過(guò)CaM-Ks/Raf/MEK/ERK通路使外泌體高表達(dá)MDR-1、肺抵抗蛋白（LRP）,從而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-fluorouracil的抵抗[78]。

第二種機(jī)制是腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)外泌體分泌蛋白質(zhì),中和胞外的蛋白質(zhì)抗體藥物。乳腺癌細(xì)胞對(duì)HER2抗體trastuzumab抵抗的研究發(fā)現(xiàn),抵抗的腫瘤細(xì)胞通過(guò)外泌體向胞外分泌HER2,HER2與抗體藥物結(jié)合,減少抗體藥物與腫瘤細(xì)胞作用的藥物濃度,從而促進(jìn)乳腺癌的藥物抵抗[79]。

第三種機(jī)制是細(xì)胞之間通過(guò)外泌體交流,賦予了敏感腫瘤細(xì)胞抗藥特性。舒尼替尼抵抗是導(dǎo)致腎細(xì)胞癌治療失敗的重要原因,研究發(fā)現(xiàn)舒尼替尼抵抗的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與敏感細(xì)胞相比表現(xiàn)出lncARSR高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),外泌體可以將lncARSR傳遞至受體敏感腫瘤細(xì)胞,致使癌細(xì)胞產(chǎn)生舒尼替尼抵抗,具體機(jī)制是lncARSR被受體細(xì)胞攝取后,可以充當(dāng)miR-34/miR-449的ceRNA,減弱miR-34/miR-449對(duì)AXL和c-MET的調(diào)控,促進(jìn)細(xì)胞AXL和c-MET的表達(dá)[80]。腫瘤細(xì)胞休眠有助于其抵抗化療藥物的作用,乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞釋放富含miR-222/miR223的外泌體,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞休眠,并提升其藥物抗性[81]。

4.4 外泌體參與腫瘤的放射抵抗

電離輻射損傷細(xì)胞DNA是治療腫瘤的有效方式之一[83]。盡管放射治療方法普遍使用,但是放射抵抗一直限制著腫瘤的治療效果。最新的研究發(fā)現(xiàn),外泌體促進(jìn)細(xì)胞間信息交流,參與腫瘤的放射抵抗。例如在肺癌研究中,照射處理組腫瘤細(xì)胞與未照射組相比,其產(chǎn)生的外泌體中miR1246含量更高。采用miR1246類(lèi)似物或阻斷劑處理表明,細(xì)胞外miR1246增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖,并產(chǎn)生放射抵抗;進(jìn)一步螢光素酶報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)確定miR1246是通過(guò)抑制靶標(biāo)DR5表達(dá)發(fā)揮作用[84]。乳腺癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤間質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生富含非編碼RNA的外泌體,其通過(guò)識(shí)別乳腺癌細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體RIG-1而激活受體細(xì)胞的STAT1抗病毒信號(hào)通路,從而使乳腺癌細(xì)胞具有放射抵抗[85]。頭頸部腫瘤的研究中,來(lái)源于照射處理細(xì)胞的外泌體增強(qiáng)受體細(xì)胞的放射抵抗,這可能是由于受體細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)增強(qiáng)的存活效應(yīng)[78]。這些研究充分證明了外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間分子交流在腫瘤放療抵抗中的重要性。

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞分泌產(chǎn)生外泌體,不僅是細(xì)胞排除物質(zhì)的一種方式,更是腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間交流的途徑。本文闡述了外泌體形成與分泌調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制,以及外泌體作為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì),參與腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞之間的生物信號(hào)傳遞及腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

外泌體除了在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用之外,還可作為腫瘤診斷和治療的潛在工具。通過(guò)液體活檢技術(shù)[86]在血漿、血清及腹水等人體體液中獲取外泌體,能反映其來(lái)源細(xì)胞的特征改變。Chen等[87]報(bào)道,膀胱癌患者和非癌癥患者尿液中分離出的外泌體有24個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中外泌體來(lái)源的腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2（tumor-associated calcium signal transducer 2,TACSTD2）是一種在許多癌癥中過(guò)表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白,可作為診斷膀胱癌的生物標(biāo)志物,膀胱癌患者分泌的外泌體中TACSTD2水平高于對(duì)照組病例。從不同體液中分離富集外泌體及其內(nèi)含物,有利于識(shí)別生物標(biāo)志物的信號(hào),是一種非侵入性的腫瘤診斷手段。而且,基于外泌體的靶向療法和抑制外泌體分泌更是一種新型治療策略,抑制外泌體分泌可阻止致癌分子轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤微環(huán)境,進(jìn)而減少血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。目前,將外泌體設(shè)計(jì)為藥物遞送載體裝載遞送治療性抗癌藥物以及將樹(shù)突細(xì)胞衍生的外泌體作為免疫療法的疫苗等研究均已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

盡管已有研究闡述了與外泌體形成分泌相關(guān)的分子,但由于該過(guò)程依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约皺C(jī)體的特性,同時(shí)需經(jīng)歷一個(gè)多階段多層次的調(diào)控過(guò)程,因而其具體機(jī)制仍未得到闡明。鑒于目前研

圖3 外泌體參與腫瘤藥物抵抗的途徑（改編自文獻(xiàn)[82]）Fig.3 Exosomes involved in cancer drug resistance（Adapted from reference[82]）

究外泌體的作用機(jī)制均在體外實(shí)驗(yàn)體系中完成,且細(xì)胞培養(yǎng)上清抽取與定量外泌體的實(shí)驗(yàn)方法尚未得到一致的定論,因而對(duì)外泌體相關(guān)功能的研究只是模擬一個(gè)近乎體內(nèi)的環(huán)境,況且個(gè)體差異性也會(huì)導(dǎo)致外泌體的功能呈現(xiàn)異質(zhì)性。外泌體作為目前研究的熱門(mén)領(lǐng)域,其形成與分泌機(jī)制還需更進(jìn)一步的深入探索,可以預(yù)期的是如果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體系應(yīng)用于外泌體功能研究中,將更透徹地了解其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮功能的形式,為腫瘤治療提供更有利的理論依據(jù)。