原壯壯,黃 皓,楊一峰,譚志平

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院,中國湖南長沙410011）

左右不對稱發(fā)育現(xiàn)象在自然界中普遍存在,如招潮蟹、比目魚、獨角鯨等。然而,大多數(shù)脊椎動物的不對稱隱藏在皮膚之下。人體內(nèi)臟器官在位置和模式上呈明顯的左右不對稱分布,心臟在發(fā)育過程中不對稱的環(huán)化,最終定位在胸腔左側(cè);左右肺葉數(shù)量也不盡相同;腹腔中,胃和胰臟位于左側(cè),而肝臟位于右側(cè),消化道r呈不對稱卷曲;大腦也存在形態(tài)學(xué)及功能上的左右不對稱。

纖毛是一類位于細胞表面的毛發(fā)狀結(jié)構(gòu),在發(fā)育中起重要作用,并與多種疾病（如內(nèi)臟異位）密切相關(guān)。臨床資料及動物模型研究證實纖毛參與左右發(fā)育過程,左右不對稱（L-R asymmetry）發(fā)育異常的患者及實驗動物往往伴有纖毛缺陷。左右不對稱發(fā)育異常又稱偏側(cè)發(fā)育缺陷（laterality defect）,是一類以內(nèi)臟器官沿身體垂直軸異常排列為主要特征的疾病,它包括內(nèi)臟反位和鏡面右位心等。流行病學(xué)調(diào)查表明其在新生兒發(fā)病率約為1/10 000[1]。左右不對稱發(fā)育異?；颊咧邢忍煨孕呐K病發(fā)病率顯著增加,單心室、單心房、大動脈轉(zhuǎn)位和室間隔缺損尤為普遍;同時還包括多脾癥、中位肝、肝外膽管閉鎖等心外畸形[1,2]。原發(fā)性纖毛運動障礙（primary ciliary dyskinesia,PCD）患者常并發(fā)反復(fù)呼吸道感染、鼻竇炎、支氣管擴張和內(nèi)臟反位等疾病。

1 纖毛的結(jié)構(gòu)和分布

纖毛可分為軸絲、纖毛基質(zhì)和纖毛膜三部分[3,4]。軸絲由環(huán)形排列的9組二聯(lián)微管及多種附屬蛋白質(zhì)構(gòu)成,中心可能存在一對中心微管,而纖毛膜均勻地包裹在軸絲外圍,在軸絲和纖毛膜之間填充著纖毛基質(zhì)[5,6]。

根據(jù)纖毛運動性和是否具有中心微管,可以將其分為 3 種類型:“9+2”運動型、“9+0”運動型和“9+0”不動型[7]（圖1）。運動型纖毛的二聯(lián)管上有動力蛋白臂,動力蛋白臂之間相互滑動產(chǎn)生驅(qū)動力使纖毛彎曲[8,9]。動力蛋白臂有兩種類型:外動力蛋白臂和內(nèi)動力蛋白臂,由動力蛋白的重鏈、中鏈、輕鏈以及輔助蛋白質(zhì)構(gòu)成[10]?！?+2”運動型纖毛主要包括呼吸道上皮細胞纖毛、腦室室管膜細胞纖毛、生殖道上皮細胞纖毛以及精子的鞭毛等,呈平面擺動并產(chǎn)生定向液流?！?+0”運動型纖毛僅包括胚胎節(jié)點纖毛,和“9+2”運動型纖毛結(jié)構(gòu)相似,包含雙頭外動力蛋白臂,但沒有中心微管和輻條[10～13]?！?+0”不動型纖毛的9組二聯(lián)管沒有動力蛋白臂,沒有中心微管和輪輻結(jié)構(gòu),包括腎小管、膽管、胰管上皮纖毛以及骨細胞/軟骨細胞纖毛等。此外,視網(wǎng)膜感受器細胞的外段存在一種特殊的“9+0”不動纖毛[7,11,13～15]。有學(xué)者還提出可能存在一類“9+2”不動型纖毛,主要包括內(nèi)耳的動纖毛、靜纖毛等[14]。

2 纖毛與左右不對稱發(fā)育

在脊椎動物中,左右不對稱起源于早期出現(xiàn)在脊索末端的短暫結(jié)構(gòu)-LROs（left right organizers）,如小鼠的節(jié)點（node）、斑馬魚的庫氏泡（Kupffer’s vesicle,KV）等。盡管脊椎動物的LROs結(jié)構(gòu)不同,但破壞左右對稱的生物學(xué)機制是保守的[16]。LROs中每個細胞表面存在一根“9+0”運動型纖毛。這些纖毛旋轉(zhuǎn)運動,在LROs腔中產(chǎn)生左右不對稱的液流,然后驅(qū)動LROs周圍的基因不對稱表達[17,18]。

綜合來看,脊椎動物左右不對稱模式的發(fā)生大致需要四步:1）LROs纖毛旋轉(zhuǎn),產(chǎn)生液流打破對稱;2）LROs及其周圍產(chǎn)生的不對稱信號分子傳遞到側(cè)板中胚層;3）左側(cè)板中胚層Nodal基因及其反饋抑制基因Lefty2不對稱表達;4）Pitx2不對稱表達,Nodal信號分子誘導(dǎo)其編碼轉(zhuǎn)錄因子,使器官發(fā)生在特定位置[19,20]。

2.1 纖毛的運動性

發(fā)育初始階段胚胎是左右對稱的,這種對稱的打破依賴纖毛運動所產(chǎn)生的節(jié)點液流[15,21,22]。早期研究發(fā)現(xiàn),小鼠內(nèi)臟反位（inversus viscerum,iv）基因編碼動纖毛外動力蛋白臂的重鏈蛋白Lrd（left-right dynein heavy chain）,其突變會l成節(jié)點纖毛運動性喪失[23,24],進而導(dǎo)致左右不對稱發(fā)育異常[25]。利用原位S交和免疫熒光染色等技術(shù),在雞胚、非洲爪蟾和斑馬魚中均發(fā)現(xiàn)了Lrd表達,但其時空表達存在物種差異[26,27]。

圖1 纖毛結(jié)構(gòu)模式圖（修改自文獻[130]）（A）小鼠節(jié)點纖毛掃描電鏡圖像;（B）哺乳動物氣管細胞運動纖毛掃描電鏡圖像;（C）腎小管上皮細胞的初級纖毛;（D）9+0運動纖毛（節(jié)點纖毛）、9+2運動纖毛、9+0不動纖毛（初級纖毛）結(jié)構(gòu)模式圖。DRC,動力蛋白調(diào)控復(fù)合體。Fig.1 Ciliary structure pattern（cited from the ref.[130]with some modifications）（A）Scanning electron micrograph of mouse nodal cilia;（B）Motile cilia are usually found at a density of several hundred per cell,as shown in this scanning electron micrograph of the mammalian trachea;（C）Primary cilia are typically one per cell,as exemplified by primary cilia in renal tubule epithelia;（D）Schematic representation of a cilium,with cross sections at the distal end showing the microtubule arrangements in the nodal,motile and non-motile（primary）cilia.DRC,dynein regulatory complex.

人類DNAH11基因編碼纖毛軸絲動力蛋白臂的β鏈蛋白質(zhì)。此基因突變患者常發(fā)生內(nèi)臟異位[28]。利用基因敲除技術(shù),去除小鼠DNAH11的同源基因,發(fā)現(xiàn)發(fā)育早期左向液流消失。其可能的原因是DNAH11基因突變導(dǎo)致纖毛動力不足,不能產(chǎn)生液體流動[29]。此外,鑒定到的第一個人類PCD致病基因DNAI1,它也編碼一種動力臂蛋白[30,31]。

2.2 纖毛決定液流方向

小鼠節(jié)點纖毛向后傾斜及其順時針旋轉(zhuǎn)模式共同決定了液流的方向。節(jié)點細胞表面向后傾斜的纖毛順時針旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生向左的有效劃動和向右的恢復(fù)劃動,在凹陷的節(jié)點中產(chǎn)生向左的快速液流,在細胞表面產(chǎn)生向右的緩慢液流[32]。

在小鼠和爪蟾中,LRO纖毛極化導(dǎo)致其定位在細胞后部并向后傾斜,這一過程依賴于平面細胞極性。有研究表明小鼠節(jié)點纖毛極化是由沿前后軸分布的Wnt5活性梯度導(dǎo)致的[33,34]。二聯(lián)管環(huán)狀規(guī)r排列對節(jié)點纖毛穩(wěn)定的旋轉(zhuǎn)運動是必要的[13]。此外,輻條對節(jié)點纖毛的旋轉(zhuǎn)運動也很重要,在Rsph4a（Rsp4同源基因）敲除小鼠中,呼吸道纖毛可以像節(jié)點纖毛一樣順時針旋轉(zhuǎn),表明輻條缺失可能是纖毛運動模式轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[13,35,36]。

在人工液體流動環(huán)境中培養(yǎng)小鼠細胞的研究表明,快速右向流動可以使胚胎正常的節(jié)點液流方向逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致心臟反位;而慢速右向流動、慢速左向流動和快速左向流動均表現(xiàn)為左右發(fā)育正常[37]。

斑馬魚的庫氏泡液流情況略有不同。KV是一個內(nèi)表面分布纖毛細胞且內(nèi)部充滿液體的球體,腔內(nèi)的流體呈2形的逆時針流動。KV前端更多的是柱狀細胞,纖毛密度更高,這一排列導(dǎo)致液體流速不對稱,其中KV腔內(nèi)左前部分的流動速度最大[38,39]。

2.3 靜纖毛與液流感知

產(chǎn)生液流的動纖毛主要分布在小鼠節(jié)點中央,而靜纖毛存在于節(jié)點的邊緣[18,40]。靜纖毛細胞又被稱為冠細胞,它表達左右不對稱模式正確形成所必需的3個信號分子Nodal、Gdf1和Cerl2。靜纖毛可以感知液流,纖毛發(fā)育障礙的Kif3a-/-小鼠胚胎不能對液流作出反應(yīng);挽救冠細胞中Kif3a的表達后,胚胎重新獲得對液流信號的反應(yīng)[18]。

靜纖毛感知液流信號的細節(jié)尚不十分清楚,目前存在兩種主要的科學(xué)觀點:1）感知液流產(chǎn)生的機械力[22,41];2）液流中的某種化學(xué)因子,或攜帶該化學(xué)因子的囊泡,隨液流不對稱分布后被感知到[42]。

不對稱發(fā)生需要鈣離子（Ca2+）通道蛋白Pkd1l1和Pkd2的作用,二者可共定位在LRO纖毛上,并且都是Nodal-Pitx2通路建立所必需的[43～45]。通常,Pkd1l1表達相對局限在LROs,而Pkd2表達范圍更廣一些[18,44]。小鼠實驗發(fā)現(xiàn),Pkd1l1在Pkd2上游,發(fā)揮抑制Pkd2的作用,而Pkd2的下游靶基因是Cerl2（編碼一種Nodal拮抗物）[46]。Pkd2響應(yīng)液流中的信號從而激發(fā)纖毛內(nèi)的Ca2+信號,而后者擴散到細胞內(nèi)激活下游的通路;在小鼠胚胎的節(jié)點和斑馬魚胚胎的庫氏泡中,直接檢測到Ca2+濃度的左右不對稱[47],以上信息表明Ca2+可能參與感知液流的通路。此外,Ca2+信號抑制劑處理小鼠胚胎會擾亂節(jié)點的左右不對稱發(fā)育[40]。抑制非洲爪蟾胚胎的IP3信號,會導(dǎo)致左右模式隨機化[48]。

2.4 不對稱信號的傳導(dǎo)

起源于LROs的不對稱信號被傳導(dǎo)到側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm,LPM）,激活Nodal表達,并進一步激活Pitx2的表達[49]。小鼠胚胎上的Ca2+（L>R）信號由節(jié)點向兩側(cè)擴散,可能是通過縫隙連接的內(nèi)胚層細胞到達LPM[41,50]。LRO到LPM的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans,sGAGs）參與[51]。sGAGs位于內(nèi)胚層和中胚層之間的一層基底膜中,Ca2+通過內(nèi)胚層細胞之間的縫隙連接傳播,引起sGAGs的分泌增加,從而促進Nodal蛋白的轉(zhuǎn)移[52,53]。但斑馬魚中的情況并不完全一致,缺少LRO-spaw表達或spaw基因突變的斑馬魚LPM仍然表達Spaw[54,55]。

Nodal信號終止后,Pitx2在左側(cè)板中胚層的表達仍持續(xù)數(shù)個小時,最初曾認為Pitx2是Nodal信號下游驅(qū)動器官不對稱形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵基因。雖然在側(cè)板中胚層Pitx2表達缺失的小鼠模型中大多數(shù)器官都表現(xiàn)出左右異常,例如心血管系統(tǒng)和肺的結(jié)構(gòu);但仍有一些不對稱發(fā)生并未被Pitx2缺失所影響,例如心臟環(huán)化和胃的偏側(cè)性,這表明不依賴于Pitx2的Nodal下游信號通路對某些器官不對稱形態(tài)的發(fā)生也很重要[56]。

Nodal-Pitx2通路在調(diào)控心臟的不對稱發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。心臟發(fā)育過程中,在對稱的心錐階段,左側(cè)心臟祖細胞收到來自左側(cè)板中胚層前部的Nodal信號,該信號驅(qū)使左側(cè)的細胞更快速的遷移[57,58]。在缺乏Southpaw/Spaw（Nodal同源物）的斑馬魚胚胎,其兩側(cè)的心臟祖細胞都遷移緩慢[59]。目前有關(guān)Nodal信號增加細胞遷移速率的機制還不清楚,但已經(jīng)鑒定出一些心臟祖細胞Spaw靶標[58,60]。其中一種靶標是透明質(zhì)酸合成酶2（hyaluronan synthase 2,Has2）,是一種細胞外基質(zhì)修飾酶,其在左側(cè)心臟祖細胞的表達水平高于右側(cè),可能抑制BMP活性;另一種是非肌細胞肌球蛋白II（nonmuscle myosin II）亞基,其表達被Nodal活性所抑制[60]。

3 左右不對稱發(fā)育與先天性心臟病

研究表明,約有80%的左右不對稱發(fā)育異?；颊吆喜?fù)雜先天性心臟?。╟ongenital heart disease,CHD）[61],這可能是由心臟環(huán)化異常所致。從生物進化角度來看,心臟環(huán)化過程保守,原始心管通過彎曲形成左右不對稱的扭曲結(jié)構(gòu)。心管首先向腹側(cè)彎曲,然后向右螺旋扭轉(zhuǎn),稱為“右袢（DLoop）”（圖2）[62]。心臟環(huán)化依賴于相關(guān)基因表達和機械力的協(xié)調(diào)作用。抑制斑馬魚spaw基因的表達,其中70%的心臟仍正常右旋環(huán)化,這提示在Nodal信號缺失時,心臟的正確環(huán)化可能由另一種尚未探明的機制所控制[54,57]。同樣,有研究表明Pitx2不是斑馬魚和小鼠心臟環(huán)化所必需的,提示Nodal可不依賴于Pitx2而單獨作用[63]。

動脈弓也存在左右不對稱發(fā)育的過程。哺乳動物胚胎有5對動脈弓。小鼠胚胎在E10.5到E11.5的24 h內(nèi),或人類胚胎在大約5 d內(nèi),動脈弓系統(tǒng)經(jīng)歷了復(fù)雜而廣泛的不對稱重構(gòu)。左側(cè)的第四和第六動脈形成主動脈和肺動脈干,而右側(cè)r退化。在Pitx2突變體中,右側(cè)的第六弓動脈沒有退化,說明Nodal-Pitx2通路參與動脈弓的左-右不對稱發(fā)育[64]。然而,對于不存在于弓動脈中的Pitx2是如何影響前者的左右不對稱重構(gòu)仍不清楚。一個可能的原因是Pitx2支配著第二生心區(qū)的形態(tài)發(fā)生[65]。正常情況下,流出道（outflow tract,OFT）螺旋旋轉(zhuǎn)約180。,然后在動脈極旋轉(zhuǎn)的驅(qū)動下回旋90。,使右側(cè)第六弓動脈的入口與主動脈相鄰,且右側(cè)第六弓動脈相比于左側(cè)更狹窄、更長,這導(dǎo)致流經(jīng)其中的血流量減少,進而減少血小板源生長因子和血管內(nèi)皮生長因子,最終導(dǎo)致右側(cè)的第六弓動脈退化[64]。這些結(jié)果表明Pitx2驅(qū)動OFT手性旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致血流左右不對稱分布。

4 與左右不對稱發(fā)育相關(guān)的重要疾病基因

臨床觀察發(fā)現(xiàn)左右不對稱發(fā)育異常多見于內(nèi)臟異位和PCD病人。PCD是一類罕見的因“9+2”運動型纖毛結(jié)構(gòu)缺陷和/或功能障礙,累及多器官的隱性遺傳病。在一項包括305例典型PCD患者的研究中,143（46.9%）例患者內(nèi)臟正位（situs solitus,SS）;125（41.0%）例鏡面異位（situs inversus totalis,SI/SIT）;37（12.1%）例內(nèi)臟反位（situs ambiguus,SA）,其中SA合并復(fù)雜CHD占2.6%,合并簡單CHD占2.3%,不合并CHD占4.6%[66,67]?？紤]到節(jié)點纖毛（“9+0”運動型）和呼吸道纖毛（“9+2”運動型）的結(jié)構(gòu)和分布并不一樣,因此我們推測PCD與內(nèi)臟異位合并復(fù)雜CHD可能是兩種不同亞型的纖毛病,其致病基因不盡相同,但也應(yīng)該存在重疊部分。

迄今為止,得℃于高通量測序和人類遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,17種單純參與左右不對稱發(fā)育基因（表1）[68～84]和41種PCD致病基因得以鑒定（表2）[30,85～129]。此外,利用化學(xué)誘變技術(shù)在模式動物小鼠中進行正向遺傳學(xué)篩選,鑒定到一系列的導(dǎo)致左右不對稱發(fā)育異常和CHD的基因,如Pkd1l1、Mmp21、Gm572、Tbc1d32、Cc2d2a、C2orf74 等[130],前兩個重要候選基因（Pkd1l1、Mmp21）已在內(nèi)臟異位等病人中證實[73,74],而其他候選基因r有待更多的人類遺傳學(xué)證據(jù)。

一般而言,已鑒定的這些致病基因按照生物學(xué)功能分為以下四大類:1）與纖毛結(jié)構(gòu)和組裝及其運動性相關(guān),該類基因突變通常不能形成功能性的纖毛,多為PCD致病基因,如DNAI1、DNAH5、DNAH11等;2）與胚胎中軸線（midline）形成有關(guān),如ZIC3、LEFTYA等;3）LPM中效應(yīng)分子的編碼基因,如NODAL、PITX2等;4）參與節(jié)點和LPM之間的信號傳導(dǎo)過程,如PKD1L1、PKD2等[131]。

ZIC3 CFC1 ACVR2B NODAL CFAP53/CCDC11 MMP21 PKD1L1 LEFTY2 CRELD1 FOXH1 GDF1 SHROOM3 PKD2 MEGF8 NPHP4 NKX2.5 CFAP52/WDR16 Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect Laterality defect 300265 605194 602730 601265 614759 608416 609721 601887 607170 603621 602880 604570 173910 604267 607215 600584 609804 HTX1 HTX2 HTX4 HTX5 HTX6 HTX7 HTX8----------[68][69][70,75][70,71][69,72][73][74][75,76][76,77][71,77][78][79][80][81][82][83][74,84]

表2 PCD致病基因Table 2 The PCD disease-causing genes

（接上表）

5 展望

已有研究結(jié)果表明纖毛參與胚胎早期發(fā)育及內(nèi)臟器官的不對稱分布,但其中的復(fù)雜調(diào)控機制仍不清楚。本團隊對前期收集到的50余例右位心合并CHD患者樣本進行全外顯子測序等探索性研究,結(jié)果顯示僅10.2%的患者鑒定到已知基因的突變,這其中包括ZIC3、NKX2.5、NODAL、CCDC151、MMP21等,仍有高達約90%表型特異的患者暫時缺乏分子遺傳學(xué)解釋。同時,新近鑒定的MMP21、MEGF8、C11orf70等致病基因的生物學(xué)功能知之甚少[73,81,128],這提示纖毛與左右不對稱發(fā)育的關(guān)系仍存在較多空白地帶。隨著細胞和分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展,我們期待諸如Nodal信號啟動和維持的過程、靜纖毛感知液流具體細節(jié)、心臟環(huán)化調(diào)控機制以及人類內(nèi)臟異位分子機制等問題將有一個更清晰的答案。

當(dāng)前國際上纖毛及其相關(guān)疾病的研究競爭激烈,我國在此領(lǐng)域的原創(chuàng)性研究較少,臨床醫(yī)學(xué)研究多以病例報道為主。鑒于我國人口基數(shù)大、南方同姓氏族群聚集以及部分地區(qū)醫(yī)療水平不足等客觀現(xiàn)象的存在,已確診或潛在的纖毛相關(guān)疾病患者數(shù)量較為龐大。隨著先進的分子遺傳學(xué)技術(shù)的快速推廣,臨床上對該類疾病認識不足所l成的漏診誤診現(xiàn)象逐漸減少,因此我們樂觀期待國內(nèi)纖毛相關(guān)疾病的臨床診斷和研究有一個快速的發(fā)展。