解琪琪,李文洲,史衛(wèi)東,鄧亞軍,任恩惠,馬靖琳,康學(xué)文,汪 靜,*

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科,中國(guó)甘肅蘭州730030;2.蘭州大學(xué),中國(guó)甘肅蘭州730000;3.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)甘肅蘭州730030）

2011年,國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)（International Association for the Study of Pain,IASP）將神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain,NP）最新定義為:“由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接l成的疼痛”[1,2]。長(zhǎng)期疼痛不但會(huì)影響患者的睡眠、工作和生活能力,還會(huì)增加抑Ⅳ、焦慮等情感障礙的發(fā)病率[3]。慢性神經(jīng)病理痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),臨床治療效果欠佳。進(jìn)一步闡明NP的發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前疼痛研究領(lǐng)域的一個(gè)難題[4,5]。坐骨神經(jīng)分支選擇性結(jié)扎（spared nerve injury,SNI）是相對(duì)新型的NP模型,可用于急性長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)（>14 d）的機(jī)制探討[6],之前大部分的研究集中在神經(jīng)病理性疼痛的維持機(jī)制研究,而對(duì)于其早期（<7 d）病理性改變的分子機(jī)制研究甚少。生物信息學(xué)是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的新興學(xué)科,可為疾病的形成提供可能的分子機(jī)制依據(jù),為實(shí)驗(yàn)研究提供可行的思路[7]。本文通過生物信息學(xué)相關(guān)方法對(duì)Costigan等[8]構(gòu)建的大鼠疼痛模型表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析,以探討SNI誘發(fā)的早期神經(jīng)病理性疼痛的基因表達(dá)和生物代謝過程的改變,為神經(jīng)病理性疼痛分子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供生物信息學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)集GSE30691[8]來源于NCBI的GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù),基于GPL85平臺(tái)[RG_U34A]Affymetrix Rat Genome U34 Array,表達(dá)數(shù)據(jù)為expression profiling by array,種屬Rattus norvegicus。該芯片數(shù)據(jù)包括56只Wistar大鼠,分為坐骨神經(jīng)損傷組、脊神經(jīng)結(jié)扎組、坐骨神經(jīng)慢性壓榨損傷組、假手術(shù)組、正常對(duì)照組,各組分別于l模后3 d、7 d、21 d以及40 h取L4和L5背根神經(jīng)節(jié)以提取總RNA進(jìn)行基因芯片分析。本研究通過生物信息學(xué)分析其坐骨神經(jīng)損傷SNI術(shù)后3 d及正常對(duì)照組（N組）背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本的基因芯片數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因的篩選

通過R語言軟件包分析將原始的CEL文件通過RMA算法進(jìn)行背景校正、bootstrap校正、質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化處理,并轉(zhuǎn)化為探針表達(dá)矩陣,然后根據(jù)GLP85平臺(tái)文件將探針名轉(zhuǎn)化為基因名;通過R語言軟件包篩選出差異表達(dá)基因,差異表達(dá)基因同時(shí)滿足|log2fold change（log2FC）|>0.6且P<0.05。利用pheatmap工具包繪制熱圖,直觀地展示每個(gè)差異基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)情況。

1.3 差異表達(dá)基因的基因本體論和通路富集分析

基因本體論（Gene Ontology,GO）是用來注釋基因及其產(chǎn)物的常用方法,有利于集中研究感興趣的方向,發(fā)現(xiàn)新的現(xiàn)象。我們利用DAVID（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）在線工具（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析[9,10]。P<0.05和FDR<0.05設(shè)定為顯著性基因富集的臨界值。

1.4 共表達(dá)分析

將所得136個(gè)差異基因?qū)隨TRING（Version:10.5）在線軟件（https://string-db.org/）,得出各節(jié)點(diǎn)間的互作關(guān)系（參數(shù)為STRING數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)）。然后以TSV格式導(dǎo)出,將所得源文件導(dǎo)入Cytoscape軟件,用插件cytoHubba進(jìn)行關(guān)鍵基因（Hub基因）分析,選用MCC算法,選取得分前10為所得Hub基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理和差異基因篩選

通過對(duì)兩組差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及處理,R軟件共篩選出136個(gè)差異表達(dá)基因（SNI組/正常對(duì)照組）,其中包括98個(gè)上調(diào)基因和38個(gè)下調(diào)基因。差異基因表達(dá)的熱圖如圖1所示,可見兩組樣本基因表達(dá)具有顯著差異,上調(diào)基因主要包括GFAP、IL-6、CCL-2、JUN、CACNA2D1、PTPN5、HSPB1、GADD45A等,下調(diào)基因有KCNS3、KCNC2、GABRG2、KCNS1、SCN1A、GRIA2、SCN11A、KCNK1、VEGFA、PIK3R1等。

2.2 GO和KEGG通路富集分析

GO可分為生物過程（biological process,BP）、細(xì)胞組成（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。采用DAVID 6.8分別對(duì)136個(gè)差異基因、98個(gè)上調(diào)基因以及38個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果如圖2～4所示。差異基因主要涉及傷害刺激反應(yīng)、炎癥應(yīng)答、防御反應(yīng)等生物過程,介導(dǎo)門控性通道的活動(dòng)以及激素活力等分子功能,富集于胞外區(qū);上調(diào)基因主要涉及的生物過程跟差異基因基本一致,也富集于胞外區(qū),介導(dǎo)的分子功能有激素活力、內(nèi)肽酶抑制劑的活性以及細(xì)胞因子的活性等;下調(diào)基因r主要涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)、突觸傳遞以及離子運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過程,富集于各種離子通道上,介導(dǎo)的分子功能也是各種離子通道的活動(dòng)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示:差異基因主要涉及細(xì)胞外機(jī)制受體交互通路、FAK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路和MAPK等經(jīng)典信號(hào)通路,上調(diào)基因主要涉及MAPK信號(hào)通路、補(bǔ)體途徑信號(hào)通路、葉酸合成等信號(hào)通路,下調(diào)基因r主要涉及腎細(xì)胞癌及相關(guān)癌癥通路。

2.3 差異表達(dá)基因所編碼蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

STRING是一個(gè)由已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫(kù),本研究將136個(gè)顯著差異基因輸入STRING工具,然后將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape中,利用插件cytoHubba找出JUN、IL-6、CCL2、VEGFA、SERPINE1、TIMP1、MMP3、VIM、PLAU、SPP1為所得Hub基因（圖5）。

3 討論

近年來,關(guān)于SNI樣本的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究逐漸成為分子機(jī)制研究的熱點(diǎn)[11～13]。以往大量文獻(xiàn)及本課題組前期工作已經(jīng)證實(shí)SNI大鼠l模后1～7 d痛閾下降最顯著,7 d后趨于平穩(wěn)且維持時(shí)間較長(zhǎng)[14,15]。目前,涉及此模型的研究大多集中于維持期的機(jī)制探討,而對(duì)于其急性期痛閾下降明顯的機(jī)制研究較少[6,14],故本研究選取SNI大鼠l模后第3天的芯片數(shù)據(jù)重新進(jìn)行分析,即利用生物信息學(xué)方法比較SNI組和正常組3 d時(shí)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)樣本的差異基因表達(dá)。結(jié)果顯示,共篩選出136個(gè)DEGs,其中包括98個(gè)上調(diào)基因和38個(gè)下調(diào)基因。

圖2 差異基因GO分析及通路富集分析Fig.2 GO and pathway enrichment analyses of differential genes

圖3 上調(diào)基因GO分析及通路富集分析Fig.3 GO and enrichment analyses of pathways for up-regulated genes

圖4 下調(diào)基因GO分析及通路富集分析Fig.4 GO and enrichment analyses of pathways for down-regulated genes

上調(diào)基因GFAP、IL-6、CCL-2、CACNA2D1、JUN、PTPN5、HSPB1、GADD45A等主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)。功能富集分析顯示,SNI相關(guān)基因與細(xì)胞外基質(zhì)受體交互通路有關(guān)。之前的研究曾指出,此信號(hào)通路在SNI的進(jìn)展中起著重要作用[16,17]。因此,細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)的改變可使神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和進(jìn)展。HSPB1在SNI的研究中有見報(bào)道[12],但是,對(duì)于其導(dǎo)致SNI發(fā)生的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。下調(diào)基因VEGFA、FH1、PIK3R1、KCNS3、KCNC2、GABRG2、KCNS1、SCN1A、GRIA2、SCN11A、KCNK1等主要富集在離子通道活性的生物學(xué)功能中。已有研究報(bào)道,離子通道活性的改變與SNI發(fā)生和發(fā)展互為因果[18～20]。此外,KEGG通路富集分析顯示,MAPK信號(hào)通路在SNI中起著一定作用。MAPK包括ERK、p38、JNK和ERK5共4個(gè)亞族,4個(gè)亞族在SNI的發(fā)病中均有一定作用[21～24]。大量研究表明,MAPK在脊髓損傷后的膠質(zhì)細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞）中激活,阻斷該通路能夠抑制減弱不同動(dòng)物模型中的炎癥和神經(jīng)性疼痛[25,26]。因此,MAPK有望成為潛在的藥物治療靶點(diǎn)。利用cytoHubba分析得到的10個(gè)Hub基因JUN、IL-6、CCL-2、VEGFA、SERPINE1、TIMP1、MMP3、VIM、PLAU、SPP1 中,JUN、IL-6、CCL-2、VIM在病理性疼痛中作用研究較為深入,機(jī)制相對(duì)較為明確[27～30]。MMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一,在炎癥性疾病中扮演著重要的角色[31],而炎癥與病理性疼痛的關(guān)系又密切相關(guān)[18],因此有關(guān)其在神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制值得深入探究。VEGFA,又名血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,對(duì)于生理和病理的血管新生發(fā)揮著必不可少的作用[32]。近年來,關(guān)于VEGFA的研究主要集中于腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而在神經(jīng)病理性疼痛中研究甚少,值得進(jìn)行深入探索。SERPINE1編碼的蛋白質(zhì)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員,抑制組織纖溶酶原激活物和尿激酶的生成[33],這與PLUA的作用相反[34],值得注意的是兩者在神經(jīng)病理性疼痛中的研究均較少。SPP1編碼的蛋白質(zhì)主要參與破骨細(xì)胞的礦化及細(xì)胞因子釋放[35],而后者與病理性疼痛的關(guān)系密切,最新研究表明其與巨噬細(xì)胞的功能發(fā)揮和骨骼肌的血管生成密切相關(guān)[36],以上均提示SPP1可能參與了病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,細(xì)胞外基質(zhì)和離子通路活性的改變對(duì)SNI發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用。我們預(yù)測(cè)VEGFA、SERPINE1、TIMP1、PLAU、SPP1 可能在病理性疼痛中發(fā)揮著重要的作用;同時(shí),細(xì)胞外基質(zhì)受體交互通路和MAPK信號(hào)通路與SNI密切相關(guān),值得進(jìn)一步深入研究。