李新果，史志斌，張 磊，趙小月,王玉國，石 昂，時(shí)慶賀，陳 陸

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)在中國、澳大利亞、美國、英國等世界多國普遍流行，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，臨床上多與PRRSV、PCV-2等混合感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失，已經(jīng)成為危害養(yǎng)殖業(yè)的重要細(xì)菌性病原[1-4]。HPS血清型眾多，且在地域和時(shí)間上存在差異，中國主要流行的血清型為4、5、7、13型和不可分型(NT)[5]。因此，對(duì)不同時(shí)間、不同區(qū)域的HPS分離鑒定，尤其是對(duì)分離株血清型鑒定，對(duì)預(yù)防HPS至關(guān)重要。

目前，基因分型法成為鑒定HPS血清型的主要方法。常用的基因分型法為多重PCR分型法，與過去常用的分型方法瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比，方便快捷且不易受外界因素干擾，可提高對(duì)不可分型菌株的鑒別[4-7]。

為了解HPS在河南省的感染和流行情況，對(duì)2017—2018年河南省不同地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的送檢疑似病料，進(jìn)行HPS分離鑒定及血清學(xué)分型，旨在為副豬嗜血桿菌病的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 于2017年1月—2018年1月，采集來自南陽、新鄉(xiāng)、商丘、焦作、鶴壁、洛陽、開封、登封等地區(qū)的10個(gè)大型養(yǎng)殖場(chǎng)的疑似病豬脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)、肝臟和腦組織病料，共45份。

1.1.2 主要試劑 巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板為鄭州安圖生物工程有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)為美國BD公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為Sigma公司產(chǎn)品；新生犢牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；TaqDNA 聚合酶、DL1000 DNA Marker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株 SH0165株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)，金黃色葡萄球菌陽性菌株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 引物 參照Oliveira等[8]的方法，根據(jù)HPS 16S rRNA (M75065)的基因序列設(shè)計(jì)種特異性鑒定引物F/R。

F:5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，R:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為821 bp。參照Howell等[6]和Jia等[7]的報(bào)道，合成用于鑒定HPS血清型的引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 HPS血清型鑒定多重PCR引物及擴(kuò)增目的基因片段大小

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 剖檢疑似病豬，無菌條件下取肝臟、肺臟、脾臟、胸膜積液和關(guān)節(jié)液等病料，接種于巧克力瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。無菌條件下挑取光滑圓潤、無色透明的露珠樣菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，并挑取鏡檢可疑的單個(gè)菌落，再次接種巧克力瓊脂平板純化，備用。

1.2.2 病原菌DNA提取及PCR鑒定 挑取純化后的單菌落，溶于30 μL單蒸水中，混勻后，煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA[9]。PCR擴(kuò)增方法按Oliveira等[8]的方法進(jìn)行。

1.2.3 病原菌衛(wèi)星試驗(yàn) 將PCR檢測(cè)HPS為陽性的可疑菌落水平劃線于綿羊鮮血麥康凱瓊脂平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星生長現(xiàn)象。

1.2.4 病原菌血清型鑒定 根據(jù)Howell等[6]和Jia等[7]建立的多重PCR方法，鑒定HPS的血清型。煮沸法制備待測(cè)菌株基因組DNA，按照表1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL:TaqDNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，待檢DNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL，80 V電壓2%瓊脂糖凝膠電泳1 h，AlphaImager Ep型成像儀拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

將病料接種于含NAD的巧克力瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察到1～2 mm左右針尖大小、灰白色半透明、圓潤的菌落(圖1)。單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，結(jié)果為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，有細(xì)長、桿狀的菌體(圖2)。

圖1 病原菌在巧克力瓊脂平板的菌落形態(tài)

圖2 病原菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 病原菌PCR鑒定結(jié)果

對(duì)2.1中篩選獲得的12株疑似HPS菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，12株菌株均能擴(kuò)增出預(yù)期821 bp的目的條帶，且與標(biāo)準(zhǔn)株SH0165位置一致(圖3)，鑒定為HPS陽性，初步確定為HPS。

M:DL1000 DNA Marker; 1:LY-1株; 2:ZJ-1株;

2.3 病原菌衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果

分離HPS菌株離金黃色葡萄球菌菌苔越近的菌落長勢(shì)越好，越遠(yuǎn)的菌落越小甚至未出現(xiàn)菌落，呈衛(wèi)星生長現(xiàn)象(圖4)。

2.4 病原菌多重PCR鑒定血清型結(jié)果

對(duì)HPS LY-1、NY-1株等12株分離株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，HB-1、XX-3株擴(kuò)增出約180 bp的目的片段，與funB基因大小一致，鑒定為血清1型；XX-4株擴(kuò)增出約295 bp的目的片段，與wzx基因大小一致，鑒定為血清2型；JZ-1株擴(kuò)增出約320 bp的目的片段，與wciP基因大小一致，鑒定為血清4型；LY-1、KF-1、DF-1、XX-2株擴(kuò)增出約450 bp的目的片段，與wcwK基因大小一致，鑒定為血清5型；XX-1、SQ-2株擴(kuò)增出約490 bp的目的片段，與funQ基因大小一致，鑒定為血清7型；NY-1株擴(kuò)增出約840 bp的目的片段，與gltP基因大小一致，鑒定為血清13型。SQ-1株未能擴(kuò)增出任何片段，鑒定為不可分型(NT)。HPS分離株詳細(xì)信息見表2。

1:金黃色葡萄球菌；2:HPS

M:DL1000 DNA Marker; 1:HB-1株; 2:XX-4株;

表2 病原菌分離株命名、來源、血清分型

3 結(jié)論與討論

HPS是一種革蘭陰性細(xì)菌且具有宿主特異性，是豬革拉瑟氏病的病原菌，在臨床上常引起以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身感染性疾病[10-11]。近年來，由HPS感染導(dǎo)致豬革拉瑟氏病的發(fā)病率和死亡率顯著上升，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬革拉瑟氏病在臨床診斷中十分常見，但其病原菌的分離比較困難，原因主要有以下3個(gè)方面：病料方面，從病料中分離該菌的最佳時(shí)間是12 h內(nèi)，但臨床分離一般都會(huì)超過最佳分離時(shí)間，所以不易分離病原菌，且病料采集部位也會(huì)影響分離率； HPS生長特性方面，該菌生長條件嚴(yán)苛，培養(yǎng)基中必須添加NAD和血清才能生長，培養(yǎng)48 h菌落才明顯可見，且在分離培養(yǎng)時(shí)，易被其他細(xì)菌掩蓋或污染，導(dǎo)致分離失??；臨床藥物使用方面，臨床上對(duì)于副豬嗜血桿菌病的防治大多會(huì)使用抗生素，對(duì)于使用過抗生素的病豬，更不易分離病原菌。本研究針對(duì)以上原因，采取了以下方法分離HPS，采集HPS易感染的肺支氣管和淋巴結(jié)等部位的新鮮病料，并且分離時(shí)要避免污染；分離培養(yǎng)時(shí)，初步分離使用巧克力瓊脂培養(yǎng)基，挑取灰白色圓潤針尖狀菌落進(jìn)行純化，純化后鏡檢再進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

HPS經(jīng)典血清型分型方法是瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，但由于陽性血清不易制備，不可分型比率高，所以逐漸被多重PCR分型方法取代。Ma等[5]在2016年運(yùn)用多重PCR方法和瓊脂擴(kuò)散法對(duì)中國分離株進(jìn)行血清型分型，兩者分型結(jié)果一致，主要流行菌株血清型是4、5、7、13、NT型(不可分型)，且多重PCR分型方法明顯降低NT的比率。Jia等[7]在2017年運(yùn)用經(jīng)典分型法和多重PCR分型法對(duì)2007—2015年南方HPS分離株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果表明，這2種方法鑒定的主要流行血清型結(jié)果一致，南方流行血清型為2、4、5、12、13、NT型。魏興良[11]等于2013年對(duì)四川省HPS進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示，四川存在血清型有4、5、10、12、13、NT型。王樂[3]研究表明，河南省2010—2012年流行菌株血清型是4、5、12、13、14型。本研究分離的HPS血清型為1、2、4、5、7、13型，其中1型、5型和7型為主要血清型，與2016年國內(nèi)流行菌株相比，河南省存在血清型1型和2型，與2014年河南省流行趨勢(shì)相比，5型依舊為主要血清型，但也存在差異，強(qiáng)毒血清型1型為新增流行血清型，中等毒力血清型2型，不致病血清型7型也都存在。本研究結(jié)果表明，除5型外，1型可能為河南省HPS血清型新的流行趨勢(shì)。近幾年，血清7型的臨床分離率也逐漸升高[12-13]，Ma等[5]從發(fā)生副豬嗜血桿菌病的臨床病例中分離到了血清7型，之前研究表明，血清7型為不致病血清型，其致病特性有待進(jìn)一步研究[12]。

本研究從河南省采集的病料中成功分離12株HPS，血清型分別是1、2、4、5、7、13、NT型，不同地區(qū)血清型不同，證實(shí)了HPS血清型存在區(qū)域性，提示要針對(duì)本地區(qū)流行菌株的血清型使用對(duì)應(yīng)的疫苗，從而進(jìn)行有效的預(yù)防和治療。