李宏梁，尉璐杰，王 歡，杜 磊，黃峻榕，孫寶國，2*，劉小晶，雷 靜

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室，北京 100048；3.陜西宏梁食品科技有限公司，陜西 西安 710065）

納豆是將大豆煮熟后，接種納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）（納豆菌）后發(fā)酵形成的食品[1-2]。最先起源于中國豆豉，公元前300年流傳至日本[3]。納豆菌是美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）公認的40種益生菌之一[4]，對動物和環(huán)境安全，可以調整動物腸道的菌群平衡，提高免疫功能[5]。納豆激酶是納豆芽孢桿菌代謝中的特征性產(chǎn)物，屬于堿性絲氨酸蛋白酶[6]，具有高效纖維蛋白溶解活性[7]，可直接通過腸胃系統(tǒng)被人體吸收[6]。動物試驗[8-10]和人體試驗[11]均已證實納豆激酶是用于治療心血管疾病的安全、高效、低廉的純天然補充劑[12]。此外，納豆中還含有維生素K（vitamin K，VK）、大豆異黃酮、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種生理活性成分，具有防癌、抗癌、防衰老的功效。

目前，納豆已成為日本人日常飲食的必備食物，被認為是日本人長壽的“秘方”[13]。日本政府早在1983年就制定了納豆的行業(yè)標準，納豆的科學研究和食品工業(yè)均已取得了巨大成績[14]。近年來，雖然有不少科研單位和企業(yè)已開始涉及納豆及納豆深加工研發(fā)，并取得了一些成果，如天津百德的凍干納豆、北京燕京的風味系列納豆等[13]。但由于納豆特有的氨腥味，至今未被我國大多數(shù)人接受，且市售納豆產(chǎn)品品種較少，對市售納豆品質方面的檢測鮮有報道，而關于國產(chǎn)鮮納豆與進口鮮納豆的品質對比研究未見報道，并且相比于納豆類保健品，納豆食品價格低廉，具有更廣泛的潛在消費者[15]。所以有必要對市售納豆產(chǎn)品的品質進行研究，以便了解國產(chǎn)納豆與進口納豆之間的差異，促進我國納豆食品工業(yè)的發(fā)展。

因此，本研究以市售5種國產(chǎn)鮮納豆和5種日本鮮納豆為研究對象，對其感官、納豆芽孢桿菌活菌數(shù)、納豆激酶酶活力進行分析比較，旨在了解國產(chǎn)鮮納豆與日本鮮納豆在感官品質、活菌數(shù)和酶活力上的不同，為我國納豆食品工業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品

鮮納豆N1：珠海市售；鮮納豆N2：青島市售；鮮納豆N3：北京市售；鮮納豆N4：大連市售；鮮納豆N5：大連市售；鮮納豆N6～N10：日本市售。

1.1.2 主要試劑

尿激酶（1240 IU/mL）、牛纖維蛋白原、牛血凝血酶（1 BP/mL）：中國食品藥品檢定所；瓊脂糖（分析純）：法國Biowest公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板計數(shù)瓊脂（platecountagar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

LDZX-40Ⅱ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；TH-2050R臺式高速冷凍離心機：上海博翎儀器設備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 納豆感官評定

納豆感官評定采用5個指標：色澤、香氣、口感、拉絲、粘液[16]，納豆評分標準：滿分100分（每項各占20分），0分最差，10人雙盲評定打分，然后取平均分。感官評定標準見表1[17]。每個樣品重復測定3次。

表1 納豆感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of natto

1.3.2 納豆芽孢桿菌活菌數(shù)檢測

將15～20 mL冷卻至46℃的PCA培養(yǎng)基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻，靜置于水平操作臺待其凝固；將待測樣品用無菌生理鹽水制成不同稀釋度的樣品勻液；吸取0.1 mL樣品勻液于無菌平皿內，及時用涂布器將稀釋液涂布均勻，每個稀釋度做三個平皿。同時，分別吸取0.1 mL空白稀釋液加入三個無菌平皿內做空白對照；將平板翻轉，（37±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》測定納豆芽孢桿菌活菌數(shù)。

1.3.3 納豆激酶活力檢測

本實驗采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測納豆激酶活力[18-19]。

大概一個多星期，我的癥狀再次加重了。但這次沒有霧霾。也沒有雪。老婆再次提及去省城，我依舊拒絕。老婆不悅，說我太固執(zhí)，早晚會在這方面吃虧的。我說：你少給我扯，這和我固執(zhí)沒關系，是因為這個冬天一直沒有下雪。

纖維蛋白平板制作：取10 mL纖維蛋白原液于燒杯中，邊攪拌邊加入55℃瓊脂糖溶液10 mL，凝血酶溶液1.0 mL，立即混勻，快速倒入培養(yǎng)皿中，室溫水平放置1 h，冷卻后放入冰箱4℃冷藏備用。

標準曲線繪制：將1240 IU/mL的尿激酶標準品用0.9%生理鹽水溶液定容至10 mL，制成酶活為124 IU/mL尿激酶溶液，用生理鹽水溶液依次制備成100 IU/mL、80 IU/mL、60IU/mL、40IU/mL、20IU/mL，備用。以尿激酶標準品酶活力的對數(shù)值為橫坐標（x），尿激酶標準品溶圈兩垂直直徑乘積的對數(shù)為縱坐標（y），計算標準曲線回歸方程。

供試品溶液的制備[20]：稱取供試鮮納豆樣品10 g，加入0.9%的生理鹽水50 mL，4℃浸提12 h，4 500 r/min冷凍離心20 min，上清液即為納豆固體發(fā)酵粗酶液。取上清液并稀釋成標準曲線范圍內的濃度，按照尿激酶標準曲線回歸方程計算納豆激酶活力。

2 結果與分析

2.1 納豆感官評定結果

按照表1對10種供試產(chǎn)品進行感官評定，從色澤、香氣、口感、拉絲長度、粘液5個方面綜合評分，結果見圖1。

圖1 納豆樣品的感官評分結果Fig.1 Sensory evaluation results of natto samples

由圖1可知，N5和N3納豆樣品感官評分較高，分別為93分、90分。N1和N6納豆樣品感官評分較低，分別是51分、53分。綜合10種市售鮮納豆感官評定結果，大多數(shù)鮮納豆口感酥軟，粘性較強，拉絲長度＞9 cm，符合理論中對鮮納豆組織狀態(tài)的描述[17]。其中，僅有1種日本鮮納豆（N6）口感偏硬，1種國產(chǎn)鮮納豆（N1）和1種日本鮮納豆（N10）的拉絲長度＜10 cm。

2.2 納豆芽孢桿菌活菌數(shù)檢測結果

2.2.1 納豆芽孢桿菌的菌落與細胞形態(tài)

在進行活菌計數(shù)前，先對納豆芽孢桿菌進行形態(tài)觀察，對符合生理學形態(tài)的菌落進行計數(shù)以確保計數(shù)準確。將納豆菌懸液涂布于PCA平板上培養(yǎng)48 h后，革蘭氏染色并鏡檢，觀察納豆芽孢桿菌菌落和細胞形態(tài)，結果見圖2。

圖2 納豆芽孢桿菌在PCA平板上的菌落（A）和細胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony(A)and cell(B)morphology of Bacillus natto on PCA plate

由圖2A可知，納豆芽孢桿菌（B.natto）在PCA平板上菌落為灰白色，近圓形，表面干燥，不透明，有褶皺，無光澤，邊緣不光滑成裂葉狀，中間向上突起，顏色深于邊緣部分。由圖2B可知，納豆芽孢桿菌（B.natto）菌體呈桿狀，可觀察到芽孢，長度約2.0～3.0μm，革蘭氏染色呈陽性。因為納豆芽孢桿菌（B.natto）屬于枯草芽孢桿菌屬（Bacillus）[21]，以理論中對枯草芽孢桿菌的形態(tài)描述[22]為參考，對符合上述納豆芽孢桿菌（B.natto）生長形態(tài)的菌落進行計數(shù)。

由于納豆芽孢桿菌（B.natto）具有抗氧化、降血壓、溶血栓等多種生理保健功能，其活菌數(shù)含量是判定納豆產(chǎn)品品質的重要指標[23]。按照1.3.2中方法對10種供試鮮納豆產(chǎn)品進行納豆芽孢桿菌活菌計數(shù)，結果見圖3。

圖3 納豆芽孢桿菌活菌計數(shù)結果Fig.3 Results of viable count of Bacillus natto

由圖3可知，10種市售鮮納豆的活菌數(shù)均在1×108～3×109CFU/g之間。其中，N2和N10納豆樣品活菌數(shù)較多，分別為1.71×109CFU/g、2.96×109CFU/g；N1和N9納豆樣品活菌數(shù)較少，分別為2.43×108CFU/g、4.20×108CFU/g。

2.3 納豆激酶活力檢測結果

由于納豆激酶具有可口服、安全性高、價格低和纖溶活力強等優(yōu)勢[24]，其酶活力是判定納豆產(chǎn)品品質的另一重要指標。

2.3.1 尿激酶標準曲線繪制

按照方法1.3.3，以不同濃度的尿激酶標準品酶活力的對數(shù)值為橫坐標（x），纖溶圈兩垂直直徑乘積的對數(shù)值為縱坐標（y），繪制尿激酶的標準曲線，結果見圖4。

圖4 尿激酶標準曲線Fig.4 Standard curve of urokinase

由圖4可知，尿激酶活力在20～100 IU/mL范圍內時，尿激酶活力的對數(shù)值與垂直直徑乘積的對數(shù)值呈線性關系，這與謝平會等[25]的研究結果一致。直線回歸方程為y=1.148 23x+0.062 86，R2=0.999 84，線性相關性良好，可用于納豆激酶活力的測定。

2.3.2 供試鮮納豆酶活力檢測結果

圖5 鮮納豆N1～N10的纖溶效果Fig.5 Fibrinolytic effect of fresh natto N1-N10

由圖5可知，10種市售鮮納豆產(chǎn)品均能產(chǎn)生透明水解圈，這說明納豆在發(fā)酵及冷藏運輸中，并不會使納豆激酶完全失活，且與尿激酶相比，納豆激酶出現(xiàn)纖溶圈的時間至少提前2 h，即納豆激酶的纖溶活力遠大于尿激酶的纖溶活力，這與YUAN J等[26]的研究結果一致。

圖6 納豆激酶活力檢測結果Fig.6 Detection results of nattokinase activity

由圖6可知，N2和N10納豆樣品酶活力較高，分別為2 415.13 IU/g、1 643.77 IU/g；N1和N9納豆樣品酶活力較低，分別為406.82 IU/g、576.16 IU/g。由此可見，市售鮮納豆中納豆激酶活力至少可維持在400 IU/g以上，最高不超過2 500 IU/g。

3 結論

本研究通過檢測5種國產(chǎn)和5種日本市售鮮納豆中納豆芽孢桿菌活菌數(shù)和納豆激酶活力，并結合感官評定分數(shù)對國產(chǎn)鮮納豆與日本鮮納豆進行分析比較。感官評分結果表明，10種市售鮮納豆大多數(shù)口感酥軟，粘性較強，拉絲狀態(tài)較好（＞9 cm），僅有1種日本鮮納豆（N6）口感偏硬，1種國產(chǎn)鮮納豆（N1）和1種日本鮮納豆（N10）的拉絲長度＜10cm；活菌計數(shù)結果表明，10種市售鮮納豆活菌數(shù)均在1×108～3×109CFU/g，其中活菌數(shù)＞1.5×109CFU/g的為1種國產(chǎn)鮮納豆（N2）和一種日本鮮納豆（N10）；活菌數(shù)＜1.0×109CFU/g的為1種國產(chǎn)鮮納豆（N1）和1種日本鮮納豆（N9）。酶活力結果表明，10種市售鮮納豆中酶活力均在400 IU/g以上，其中酶活力＞1 500 IU/g的為1種國產(chǎn)鮮納豆（N2）和1種日本鮮納豆（N10）；酶活力＜600IU/g的為1種珠海鮮納豆（N1）和1種日本鮮納豆（N9），10種鮮納豆中，有5種酶活力達到1 000 IU/g，其中包括3種國產(chǎn)鮮納豆（N2、N3、N4）和2種日本鮮納豆（N8、N10）。綜上所述，在感官方面，國產(chǎn)鮮納豆普遍優(yōu)于日本鮮納豆，在活菌數(shù)與酶活力方面，國產(chǎn)鮮納豆與日本鮮納豆差別不大，因此，我國納豆食品工業(yè)已初具競爭力，發(fā)展前景良好。