王麗媛，秦 文，李 巖，卓 勤，孫 靜，王晶波，楊 倬，黃 建，沈 葹，霍軍生，丁鋼強*

（中國疾病預(yù)防控制中心 營養(yǎng)與健康所，北京 100050）

黃酒是我國最古老的酒種，在中國乃至世界酒文化歷史上都占有重要的一席。作為我國最有發(fā)展前途的酒種之一，黃酒的功效已被大眾熟知并廣泛應(yīng)用。古今中外已有諸多記載，如《漢書·食貨志》中記載：“酒，百藥之長”；《本草綱目》記載：“諸酒醇不同，唯米酒入藥用”。米酒即指黃酒，具有通曲脈、厚腸胃、潤皮膚、養(yǎng)脾氣、扶肝、除風下氣等治療作用[1]。

隨著研究的深入，越來越多的結(jié)果顯示黃酒在抗氧化、抗衰老以及代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面具有良好功效[2]，這與黃酒中所含有的礦物質(zhì)、維生素、活性肽、糖類尤其是低聚糖密切相關(guān)[3]。功能性低聚糖是在黃酒釀造過程中曲麥微生物酶的作用下產(chǎn)生的[4]，具有低甜度和低熱量的特點，被人們稱為“膳食纖維”。已有研究表明，功能性低聚糖具有促進營養(yǎng)元素的吸收利用及改善便秘等功效[5]，在人體胃中能抵抗胃酸的分解和α-淀粉酶的水解，具有較好的穩(wěn)定性，能夠進入腸道發(fā)揮益生元的作用[6]，而黃酒對便秘癥狀的改善作用研究較少。本實驗意在研究黃酒對小鼠通便功能作用，以及對便秘小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性BALB/c小鼠共100只（無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級，體質(zhì)量18～22g，[生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2014-0006]）：購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；動物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心南緯路動物實驗室，許可證號SYXK（京）2009-0032，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。動物實驗已通過中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所倫理審查。

受試樣品：市售黃酒，標示酒精度為15.0%vol。

藥物及試劑：鹽酸洛哌丁胺膠囊（每粒含鹽酸洛哌丁胺2 mg，國藥準字H10910085）：西安楊森制藥有限公司；阿拉伯樹膠：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；活性炭粉、墨汁的配制：準確稱取阿拉伯樹膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭5 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容至100 mL，于4℃保存?zhèn)溆?，用前搖勻。0.5%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺50mg（25粒），加水至10 mL；1%鹽酸洛哌丁胺混懸液的配制：取鹽酸洛哌丁胺100 mg（50粒），加水至10 mL。均臨用前配制。

1.2 儀器與設(shè)備

RV10 V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機：德國EPPENDRF公司；Illumina HiSe2500測序儀：美國Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 小腸墨汁推進率實驗

健康雄性BALB/c小鼠共50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機分為空白對照組、模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只。人體推薦量的10倍為中劑量組，另設(shè)5倍低劑量組和30倍高劑量組。按照《中國居民膳食指南》2016新版建議男性每日飲酒的酒精量不超過25 g為參照，標準人體質(zhì)量60 kg計算，人體每日飲酒量為100 mL，低劑量組=8.3mL/（kg·BW）、中劑量組=16.6mL/（kg·BW）、高劑量組=50mL/（kg·BW）。將黃酒進行濃縮，用15%vol酒基按比例進行調(diào)配。高、中、低劑量組灌胃受試樣品，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水，灌胃體積0.2mL/（10g·BW）。連續(xù)灌胃15 d后，各組小鼠禁食不禁水24 h。除空白對照組外，其他各組以0.5%鹽酸洛派丁胺混懸液，按末次稱質(zhì)量對應(yīng)的灌胃量給予灌胃，空白組灌胃蒸餾水。30 min后以0.4 mL每只給予各組小鼠墨汁灌胃，25 min后立即脫頸椎處死，解剖分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，輕拉成直線，測量小腸總長度及墨汁推進最前端長度，計算小腸墨汁推進率。

1.3.2 排便時間及糞便質(zhì)量實驗

另50只健康雄性BALB/c小鼠，實驗方法同小腸推進率實驗。便秘藥物為1%鹽酸洛派丁胺混懸液。小鼠墨汁灌胃后，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌墨汁開始，記錄每只動物首粒排黑便時間及5 h內(nèi)排黑便的質(zhì)量。

1.3.3 腸道菌群分析

無菌環(huán)境下收集排便實驗組所有動物的新鮮糞便，封裝后凍存于-80℃冰箱進行DNA提取與分析。小鼠糞便DNA提取采用華大基因自行研發(fā)試劑盒，使用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16SrDNA的V4區(qū)進行PCR擴增。

應(yīng)用Illumina HiSe2500平臺對PCR產(chǎn)物進行測序，測序類型為PE250。下機數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得clean data。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Shortreads，v1.2.11），將雙末端測序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），用于物種注釋及物種復(fù)雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS16.0處理，各組以變異數(shù)ANOVA進行比較分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，P≥0.05無顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒對小鼠體質(zhì)量的影響

表1 小腸墨汁推進率實驗各組小鼠體質(zhì)量檢測結(jié)果Table 1 Determination results of body mass of mice in the ink propelling rates experimental group

表2 排便實驗各組小鼠體質(zhì)量的檢測結(jié)果Table 2 Determination results of body mass of mice in defecation experimental group

由表1、表2可知，在小腸推進率和排便兩組實驗開始前，各組實驗動物體質(zhì)量沒有顯著差異（P≥0.05）。15 d的灌胃過程中，高劑量組小鼠的體質(zhì)量增長緩慢，在第7天和第15天小鼠體質(zhì)量與模型對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。實驗結(jié)束后，高劑量組與模型組小鼠體質(zhì)量增量差異極顯著（P＜0.01）。在實驗過程中，各組小鼠均保持正常進食進水，毛色正常，精神狀態(tài)良好。

2.2 黃酒對便秘小鼠小腸墨汁推進率的影響

采用鹽酸洛派丁胺為便秘誘導(dǎo)劑，通過抑制腸道水分泌[7]和結(jié)腸蠕動[8]建立便秘模型。表3結(jié)果顯示，便秘模型對照組小腸推進率與空白對照組差異極顯著（P＜0.01），表明小腸推進實驗中便秘模型建立成功。經(jīng)統(tǒng)計分析，高、中、低三個劑量組與便秘模型組差異不顯著（P≥0.05）。未見黃酒對便秘小鼠小腸蠕動有明顯促進作用。

表3 各組小鼠小腸墨汁推進率的檢測結(jié)果Table 3 Determination results of the ink propelling rates of different groups of mice

2.3 黃酒對便秘小鼠首粒排黑便時間和糞便質(zhì)量的影響

表4 各組小鼠首粒黑便排出時間和糞便質(zhì)量的檢測結(jié)果Table 4 Determination results of the time of discharge of the first black feces and fecalmass of different groups of mice

表4結(jié)果顯示，模型對照組與空白對照組相比，首粒排黑便時間和糞便質(zhì)量差異極顯著（P＜0.01），表明便秘模型建立成功。高、中、低劑量組與模型對照組之間差異不顯著（P≥0.05），表明黃酒沒有明顯通便功能作用。

2.4 黃酒對便秘小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 各試驗組小鼠腸道菌群多樣性分析

表5 小鼠腸道菌群α-多樣性統(tǒng)計分析Table 5 Alpha diversity statistical analysis of intestinal flora in mice

Alpha多樣性（Alphadiversity）是對單個樣品中物種多樣性的分析[9]，其中Chao指數(shù)和Ace指數(shù)反應(yīng)樣本的物種豐富度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)綜合反應(yīng)群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性。由表5可知，在物種多樣性方面，模型對照組顯著低于空白對照組（P＜0.05），高、中、低劑量組與模型對照組差異不顯著（P≥0.05），與有關(guān)研究便秘模型腸道菌群α-多樣性分析結(jié)果一致[10]。高劑量組和中劑量組在物種豐富度上顯著高于模型對照組（P＜0.05）。

2.4.2 各試驗組小鼠腸道菌群門水平變化

腸道菌群按照生理作用可分為三類：生理性菌群，主要包括雙歧桿菌、乳桿菌等專性厭氧菌，為腸道優(yōu)勢菌，對腸道正常生理功能起保護作用；條件致病菌，大腸埃希氏菌、腸球菌、梭菌等，多為專性厭氧菌，僅在滿足特定條件下對宿主產(chǎn)生影響；病原菌多為變形桿菌等，如在腸道長期定殖并大量繁殖可導(dǎo)致人體發(fā)病[11-12]。16SrDNA技術(shù)的應(yīng)用，使得DNA測序更加準確的分析腸道菌群種類及其結(jié)構(gòu)組成[13-14]。

50個樣品共計產(chǎn)生683個OTU，分屬于10個細菌門。各試驗組的大部分腸道菌群屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes），見圖1。由圖1可知，造成便秘高、中、低、模型對照組與空白對照組相比，厚壁菌門顯著降低，降低比例分別為34%、17%、36%、31%。疣微菌門和藍藻菌門顯著增加，疣微菌門增加比例均100%以上，藍藻菌門增加比例分別為59%、84%、52%、43%。

圖1 各組小鼠腸道菌群門水平豐度圖Fig.1 Phylum-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

2.4.3 各試驗組小鼠腸道菌群屬水平變化

在屬的水平上，嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、Dorea屬、Odoribacter桿菌屬、顫螺菌屬（Oscillospira）、副桿菌屬（Parabacteroides）、副普雷沃氏菌屬（Paraprevotella）、雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）含量豐富（＞1%）。高、中、低三個劑量組與模型對照組相比擬桿菌屬含量分別降低64%、59%、64%，腸球菌含量分別降低37%、47%、87%，梭菌屬含量分別降低63%、46%、13%，變形桿菌含量分別降低86%、100%、100%；高劑量組嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（主要是Akkermansia muciniphila）、乳桿菌屬的含量較模型對照組分別升高41%、38%。

黃酒中豐富的功能性低聚糖[15]能夠被腸道有益菌吸收，改善微生態(tài)環(huán)境，有利于有益菌的增值，經(jīng)代謝產(chǎn)生的有機酸使腸內(nèi)的pH值降低[16]，低pH值環(huán)境能夠調(diào)節(jié)促進專性厭氧菌在腸道的定植，使短鏈脂肪酸競爭性結(jié)合腸道上皮細胞或粘膜上受體結(jié)合位，以提高厭氧菌定植抗力[17-18]，抑制腐敗菌的生長，調(diào)節(jié)胃腸功能[19]。

已有研究表明，Akkermansia muciniphila是腸道中的一種黏蛋白降解菌[20]，在肥胖及相關(guān)代謝疾?。ㄈ缣悄虿。┲芯哂嘘P(guān)鍵作用[21]，其組成比例與宿主健康存在正相關(guān)[22]，有望成為新一代的益生菌[23]。結(jié)合本實驗結(jié)果，推測鹽酸洛派丁胺可能引起Akkermansia muciniphila含量增高，而高劑量黃酒也有顯著增加該菌含量的可能性，進一步推測高劑量黃酒組動物體質(zhì)量增長緩慢和該菌含量可能有相關(guān)性，有待深入研究。

圖2 各組小鼠腸道菌群屬水平豐度圖Fig.2 Genus-level abundance of intestinal flora in different groups of mice

3 結(jié)論

黃酒沒有顯著促進BALB/c小鼠小腸蠕動，沒有顯著縮短小鼠首粒排黑便時間以及提高糞便質(zhì)量，表明黃酒在通便功能上作用不明顯。50.0 mL/（kg·BW）劑量黃酒小鼠體質(zhì)量增長緩慢，明顯低于其他各組，該劑量黃酒在維持體質(zhì)量方面具有一定作用。黃酒能夠調(diào)節(jié)便秘小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高菌群豐富度，高劑量黃酒能夠提高嗜粘蛋白-艾克曼菌、乳桿菌的含量，并降低擬桿菌、腸球菌、梭菌和變形桿菌的比例。