續(xù)丹丹，王文平*，王 鵬，張 欣，張 建，丁 潔，冉佳欣，譚 磊，王 穎

（1.北京食品科學研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造研究所，北京 100050；3.北京市食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗二站，北京 100050；4.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

豆醬是我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味醬，是以大豆為蛋白質(zhì)原料，通過微生物數(shù)月發(fā)酵而制成[1]。因醬香味濃郁、營養(yǎng)豐富，豆醬常被人們用于佐餐調(diào)味、烹飪醬燒等。生產(chǎn)企業(yè)多以黃豆為釀造原料，故豆醬又稱為“黃豆醬”、“大豆醬”、“黃醬”等[2]。目前國內(nèi)外已對黃豆醬的加工工藝[3-4]、風味物質(zhì)組成[5-8]、微生物多樣性[9-14]等進行了較多的分析研究。豆醬生產(chǎn)過程中多采用低鹽固態(tài)發(fā)酵法，該工藝具有發(fā)酵時間短，生產(chǎn)效率高，成本低等優(yōu)勢[15]，但產(chǎn)品酯香味不足[16]。原池澆淋工藝是在低鹽發(fā)酵工藝的基礎上進行優(yōu)化，主要采用回流方式進行澆淋，同時在發(fā)酵過程中補加乳酸菌和酵母菌，以期縮短發(fā)酵周期，提高原料利用率，改善產(chǎn)品品質(zhì)等[17]。

黑豆為豆科植物大豆的黑色種子，在我國種植廣泛。作為藥食兩用類物質(zhì)，黑豆中富含蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、維生素和微量元素等多種營養(yǎng)成分[18]。隨著現(xiàn)代科技的進步，黑豆的生理功能也得到越來越多的研究，如抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂等作用；黑豆皮中富含的花青素，是良好的抗氧化劑來源[19]。隨著人們生活水平的提高，消費者更青睞于在營養(yǎng)、風味、功能性等方面表現(xiàn)更突出的豆醬產(chǎn)品。

本研究以黑豆為原料，采用原池澆淋發(fā)酵工藝制備黑豆醬，并與黃豆醬在產(chǎn)品感官、理化及微生物指標等方面進行比較分析；采用全自動氨基酸分析儀對兩種豆醬產(chǎn)品游離氨基酸的組成和含量進行對比分析；采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（headspacesolid phasemicroex traction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）對兩種豆醬產(chǎn)品揮發(fā)性風味化合物的組成和含量進行對比分析，以期為農(nóng)產(chǎn)品的深加工及豆醬產(chǎn)品多元化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)和生產(chǎn)指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

非轉(zhuǎn)基因黑豆、小麥粉、食鹽、黃豆醬：市售；米曲霉（Aspergillusoryzae）AS3.951和生香酵母：北京市食品釀造研究所提供。

1.1.2 化學試劑

3-辛醇、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素、果糖、葡萄糖、蔗糖（純度均≥99%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉、甲醛、正丁醇、硫酸鐵銨乙酸、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純），甲醇、乙腈（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9051A電熱恒溫干燥箱、DHP-9051B微生物培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；KJELTEC 2300凱氏定氮儀：美國FOSS公司；722型數(shù)顯可見分光光度計：上海光學儀器五廠有限公司；L-8900氨基酸自動分析儀：日本日立公司；5975-7890A氣相色譜-質(zhì)譜儀（配安捷倫GC多模式自動進樣器）、LC1260液相色譜儀：美國安捷倫公司；65μm PDMS/DVB萃取頭：美國Supelco有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆醬加工工藝流程及操作要點

（1）選材：選取顆粒飽滿的非轉(zhuǎn)基因黑豆和等級為標準粉的小麥粉。其中，黑豆與小麥粉的配比為6∶4（g∶g）。

（2）浸泡、蒸煮：黑豆浸泡6 h后放入筐中濾水2 h，將黑豆在壓力0.1 MPa，溫度121℃條件下蒸煮40 min，保溫保壓2 h，獲得熟料。

（3）冷卻、混勻：待黑豆熟料于冷卻槽中自然降溫至60℃時與炒制15 min的小麥粉混合均勻。

（4）制曲：當混合物料冷卻至35℃時，接種質(zhì)量比為0.03%的米曲霉AS3.951，攪拌均勻后，30℃培養(yǎng)42 h，每4～6 h翻曲一次，制得曲料；此時曲料呈黃綠色，表面有孢子。

（5）發(fā)酵：在曲料中拌入16 °Bé的鹽水（溫度50℃），鹽水與曲料配為1.5∶1.0（g∶g），攪拌均勻后放入發(fā)酵罐中于46℃條件下進行發(fā)酵，每天澆淋一次，發(fā)酵10 d。向發(fā)酵罐中補加生香酵母培養(yǎng)液（106個/mL）（添加量100 mL/kg曲料）每天澆淋一次。42℃條件下發(fā)酵40d左右，滅菌后即得黑豆醬。

1.3.2 分析檢測

感官指標及理化指標分析測定：國家標準GB 2718—2014《食品安全國家標準釀造醬》；微生物指標測定：國家標準GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》；還原糖含量測定：國家標準GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》中的高效液相色譜法；大豆異黃酮含量測定：國家標準GB/T 26625—2011《大豆異黃酮含量測定》中的高效液相色譜法。

1.3.3 游離氨基酸含量測定

游離氨基酸含量參照國家標準GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.3.4 揮發(fā)性風味化合物分析鑒定

樣品處理方法：準確稱取4.0g黑豆醬樣品于20mL頂空瓶中，加入1.0g氯化鈉調(diào)節(jié)離子強度，吸取內(nèi)標物100μg/mL 3-辛醇溶液10μL。用65μm PDMS/DVB萃取頭對樣品中的揮發(fā)性風味化合物進行富集提取。萃取溫度50℃，萃取時間40 min，振蕩速率為200 r/min，振蕩時間40 min。萃取后于氣相色譜儀進樣口解吸5 min，進行GC-MS分析。

氣相色譜（GC）條件：HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min，采用不分流模式進樣；進樣口溫度250℃。程序升溫程序：40℃保持3min，以5℃/min升至100℃，再以6℃/min的速度升至220℃并保持10 min。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為電子離子（electronionization，EI）源，電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150℃；掃描模式為全掃描，掃描范圍35～400 amu。

揮發(fā)性化合物的定性鑒別和半定量分析方法：采用美國國家標準技術(shù)研究所（National Institute of Standardsand Technology，NIST）08譜庫檢索進行化合物組成的分析，保留匹配度＞750的化合物；采用內(nèi)標半定量法（質(zhì)量濃度100μg/mL 3-辛醇溶液10μL）計算各化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆醬和黃豆醬的感官指標

表1 兩種豆醬感官指標結(jié)果Table 1 Results of sensory indexes of two kinds of bean pastes

由表1可知，與黃豆醬相比，黑豆醬的滋味醇厚、鮮美，兩種豆醬均無不良異味；黑豆醬的醬香味更濃厚，酯香味也更足；兩種豆醬外觀狀態(tài)均無霉斑及異物。結(jié)果表明，黑豆醬的感官指標已達到相關(guān)國家標準的技術(shù)要求。

2.2 黑豆醬和黃豆醬的理化指標

表2 兩種豆醬理化指標測定結(jié)果Table 2 Determination results of physiochemical indexes of two kinds of bean pastes

由表2可知，黑豆醬中氨基酸態(tài)氮含量為0.85 g/100 g，高于黃豆醬中氨基酸態(tài)氮的含量，且兩種豆醬產(chǎn)品均達到國標技術(shù)要求（≥0.30 g/100 g）。黑豆醬和黃豆醬中大豆異黃酮總含量分別為40.5mg/100g和38.6mg/100g，且黑豆醬中大豆素和大豆黃素含量均高于黃豆醬。黑豆醬中檢測出果糖和蔗糖，黃豆醬中檢測出果糖、葡萄糖和蔗糖。

2.3 黑豆醬和黃豆醬的微生物指標

表3 兩種豆醬微生物指標結(jié)果Table 3 Results of microbial indexes of two kinds of bean pastes

由表3可知，兩種豆醬中大腸菌群均＜10 CFU/g，致病菌沙門氏菌未檢出，金黃色葡萄球菌＜10 CFU/g，結(jié)果表明，兩種豆醬微生物指標均滿足相關(guān)國標要求。

2.4 黑豆醬和黃豆醬游離氨基酸分析

對兩種豆醬中游離氨基酸組成進行分析，結(jié)果見表4。由表4可知，黑豆醬和黃豆醬中均分別檢出17種游離氨基酸（含7種必需氨基酸）。黑豆醬游離氨基酸總量為3.50 g/100 g（其中必需氨基酸含量為1.51 g/100 g），其中2種鮮味氨基酸含量為0.89 g/100 g，8種苦味氨基酸含量為1.62 g/100 g，6種甜味氨基酸含量為0.94 g/100 g，1種酸味氨基酸含量為0.01 g/100 g。而黃豆醬中游離氨基酸總量為3.15 g/100 g（必需氨基酸含量為1.38 g/100 g）。

表4 兩種豆醬樣品中游離氨基酸檢測結(jié)果Table 4 Determination results of free amino acids in two kinds of soybean pastes samples

2.5 黑豆醬和黃豆醬揮發(fā)性風味化合物分析

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對兩種豆醬中的揮發(fā)性風味化合物進行分析，結(jié)果見表5。由表5可知，兩種豆醬共鑒定出103種揮發(fā)性風味化合物，其中黑豆醬中共鑒定出91種揮發(fā)性風味化合物，包括醇類11種、酚類4種、含硫化合物2種、醛酮類10種、酸類4種、酯類49種和其他類11種；黃豆醬中共鑒定出80種揮發(fā)性風味化合物，包括醇類10種、酚類3種、含硫化合物2種、醛酮類9種、酸類2種、酯類47種和其他類化合物7種。黑豆醬中鑒定出的揮發(fā)性風味化合物含量為46 698.92μg/kg，黃豆醬中鑒定出的揮發(fā)性化合物含量為25 103.05μg/kg。黑豆醬中揮發(fā)性化合物含量是黃豆醬的1.86倍，遠高于黃豆醬。這對香氣成分的形成和產(chǎn)品品質(zhì)的改善起到了積極作用。

醇類對豆醬的風味形成貢獻較大，可呈現(xiàn)令人愉快的香甜味[20]。黑豆醬中醇類含量為17 354.84μg/kg，占其揮發(fā)性風味化合物總含量的37%；其中苯乙醇、3-甲基丁醇和乙醇的含量較高，分別為10 349.46μg/kg、2 209.68μg/kg和1 225.81μg/kg。這與魏艷麗等[21]對甜面醬的研究結(jié)果較一致。黃豆醬中醇類含量為3393.13μg/kg，占其揮發(fā)性風味化合物總含量的13%；其中苯乙醇、乙醇和1-辛烯-3-醇的含量較高，分別為1156.49μg/kg、587.79μg/kg和419.85μg/kg。苯乙醇是常見的增香劑，能賦予食品玫瑰花香氣[22]。

表5 兩種豆醬中揮發(fā)性風味化合物GC-MS分析結(jié)果Table 5 Analysis results of volatile flavor compounds in two kinds of bean pastes by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

酯類是豆醬發(fā)酵過程中經(jīng)一系列酯化反應產(chǎn)生的，能賦予發(fā)酵食品中獨特的酯香味。黑豆醬中酯類的種類最豐富且含量最高，達22 198.92μg/kg，占風味化合物總量的47%。其中十六酸甲酯的含量最高，其次為十六烷酸乙酯和9,12-十八碳二烯酸甲酯，含量均＞2 000μg/kg。同樣，黃豆醬中酯類也是含量最高的化合物，為14 667.94μg/kg。其中9,12-十八碳二烯酸甲酯的含量最高，其次為2,4-己二烯酸乙酯。

醛酮類化合物的形成與醇和酚類化合物有關(guān)，對豆醬香氣的影響較大[23]。黑豆醬中醛酮類的含量為2768.82μg/kg，其中苯乙醛的含量最高，可提供水果甜香氣。黃豆醬中醛酮類含量為5 156.49μg/kg，高于黑豆醬，其中含量最高的2-甲基丁醛為發(fā)酵食品提供獨特的可可和咖啡香氣，可用作食品添加劑。

豆醬中檢出的酸類化合物種類和含量相對較少。黑豆醬共檢出4種，且均為飽和脂肪酸，含量為2 161.29μg/kg。黃豆醬中檢出乙酸和十六烷酸2種酸類，含量為507.63μg/kg。3-甲基丁酸僅在黑豆醬被檢出，且含量最高。十六烷酸又叫棕櫚酸，是一種高級飽和脂肪酸。研究認為，豆醬中的飽和脂肪酸多為乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生或由于酯類物質(zhì)分解產(chǎn)生的[24]。

酚類主要是豆醬在發(fā)酵過程中耐滲透壓酵母菌發(fā)酵葡萄糖而產(chǎn)生的[25]。黑豆醬中共鑒定出4種酚類化合物，黃豆醬中鑒定出3種。雖然酚類化合物的含量較低，但卻是豆醬香氣成分不可或缺的。2-甲氧基苯酚、4-乙基-2-甲氧基-苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚均為傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品中常見的香氣成分。

含硫化合物是含硫蛋白酶解后產(chǎn)生的[26]。兩種豆醬中均檢出3-甲硫基丙醛和糠醛2種含硫化合物，且黃豆醬中含硫化合物的總量高于黑豆醬。3-甲硫基丙醇有強烈的圓蔥、肉臭味，但稀釋后會呈現(xiàn)醬油香氣，起到提香的作用。

3 結(jié)論

以蛋白含量較高且富含功能成分的黑豆為原料，采用原池澆淋工藝制備黑豆醬，并與黃豆醬在感官、理化、微生物指標等進行比較分析，確定了兩種豆醬中游離氨基酸及揮發(fā)性風味化合物的組成和含量，結(jié)果表明，黑豆醬香氣濃郁、滋味鮮美，其氨基酸態(tài)氮含量為0.85 g/100 g。黑豆醬和黃豆醬中均分別檢出17種游離氨基酸（含7種必需氨基酸），且黑豆醬中游離氨基酸的含量高于黃豆醬，分別為3.50 g/100 g和3.15 g/100 g。黑豆醬中共鑒定出91種風味化合物，總含量為46 698.92μg/kg，包括酯類、醇類、醛酮類、酸類、酚類、含硫化合物和其他類揮發(fā)性風味化合物，半定量分析表明酯類含量最高，占揮發(fā)性風味化合物總含量的47%，其次為醇類和醛酮類。黃豆醬中鑒定出80種風味化合物，總含量為25 103.05μg/kg。原池澆淋工藝制備的黑豆醬生產(chǎn)周期短、風味品質(zhì)佳，具有良好的開發(fā)應用前景。