許超群，李 嘯，*，程 奔，黃 聰，張小龍，葉 晗

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

酵母自溶（yeast autolysis）是指酵母細(xì)胞在特定條件下，經(jīng)蛋白酶、核酸酶、脂類酶等內(nèi)源酶（系）將自身內(nèi)容物降解并釋放的過(guò)程。友好條件下的酵母自溶是安全、穩(wěn)定和高效獲得優(yōu)質(zhì)酵母溶出物（俗稱酵母抽提物）的方式。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)酵母“自溶”的研究主要集中在添加非極性有機(jī)溶劑、酸堿和無(wú)機(jī)鹽等[1-4]，通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性加速其胞內(nèi)物質(zhì)浸出。此類研究成果被廣泛應(yīng)用于酵母抽提物工業(yè)化生產(chǎn)[5-8]，一方面有微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，另一方面，引入的高濃度離子會(huì)對(duì)亞健康人群造成較大危害[9]。據(jù)報(bào)道，通過(guò)高壓均質(zhì)[10]和脈沖電場(chǎng)作用[11]破壞酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，加速酵母胞內(nèi)物質(zhì)溶出，雖然沒有外物污染風(fēng)險(xiǎn)，但大量細(xì)胞碎片難于高效分離，此類研究成果較難產(chǎn)業(yè)化。酵母抽提物現(xiàn)已作為第三代天然調(diào)味料應(yīng)用于食品工業(yè)，對(duì)其品質(zhì)提出了“綠色無(wú)公害”的要求[12]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，國(guó)際和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)酵母抽提物的總需求量分別為26萬(wàn)t和6萬(wàn)t左右，且生產(chǎn)原料基本以面包酵母為主。但由于面包酵母內(nèi)源性自溶酶（系）較為復(fù)雜，對(duì)其作用機(jī)制認(rèn)知不夠，未能充分發(fā)揮內(nèi)源酶（系）作用，導(dǎo)致自溶收率難以提高[13]，細(xì)胞內(nèi)殘留物質(zhì)多。有研究報(bào)道，添加外源酶（如木瓜蛋白酶，β-葡聚糖酶和溶菌酶）可以顯著增加酵母細(xì)胞中大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物降解，加速自溶，并獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。酵母抽提物實(shí)現(xiàn)安全清潔制造的關(guān)鍵就是自溶及酶解，故對(duì)面包酵母進(jìn)行酶聯(lián)輔助自溶工藝的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究主要考察了添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶對(duì)面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2輔助自溶過(guò)程的影響，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定各酶的最佳助溶條件，并進(jìn)一步比較驗(yàn)證單酶、雙酶和多酶聯(lián)用的助溶能力，獲得條件較為友好的面包酵母酶法輔助自溶工藝，為酵母抽提物的綠色高效開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2（CCTCCNo：M2016418）、甘露聚糖酶（有效范圍50～55℃、pH4.5～6.0，5萬(wàn) U/g）、β-葡聚糖酶（有效范圍50～55 ℃、pH 5.0～6.5，5萬(wàn)U/g）：安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（有效范圍50～60 ℃、pH5.0～7.0，10萬(wàn) U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；蝸牛酶（有效范圍30～40℃、pH5.8～7.2，對(duì)酵母細(xì)胞壁的溶解活性：每1μg的酶2 h內(nèi)30℃水浴中可有效降解1.28×106個(gè)酵母）：上海鼓臣生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型數(shù)字恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；AL204-IC型電子天平、FE20型pH計(jì)：瑞士METTLER TOLEDO公司；MA45型水分快速測(cè)定儀：黑龍江龍澤科技發(fā)展有限公司；XSP-2C型光學(xué)顯微鏡：上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司；KDN-103F型凱氏自動(dòng)定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 面包酵母FX-2酶法助溶單一對(duì)照試驗(yàn)

配制干物質(zhì)含量為13%的酵母乳，測(cè)定其pH，分別添加甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶、蝸牛酶，在各酶的有效作用范圍內(nèi)于恒溫水浴鍋中進(jìn)行面包酵母酶法助溶處理，每2 h取樣一次，測(cè)定自溶酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量及細(xì)胞死亡率。

1.3.2 分析檢測(cè)

細(xì)胞死亡率測(cè)定：取稀釋一定濃度的自溶酵母乳0.1mL，滴加次甲基藍(lán)染液0.9 mL，染色10 min，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，無(wú)色（A）為活菌，藍(lán)色（B）為死菌，計(jì)算細(xì)胞死亡率，其計(jì)算公式如下：

自溶酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量測(cè)定：取15 mL酵母乳，于5 000 r/min離心10 min，稱取5.1～6.9 g上清液，于水分快速測(cè)定儀上測(cè)定水分含量，從而計(jì)算干物質(zhì)含量。酵母細(xì)胞壁葡聚糖和甘露聚糖含量測(cè)定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14]，總氮和氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定分別采用微量凱氏定氮法和甲醛滴定法[15]。

1.3.3 面包酵母FX-2輔助自溶條件確定單因素試驗(yàn)

13%酵母乳于不同條件下進(jìn)行酶法助溶處理12 h，以細(xì)胞死亡率及離心上清液干物質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察酶添加量、pH、溫度對(duì)各酶（甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶）輔助酵母自溶過(guò)程的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量、pH、溫度3個(gè)對(duì)面包酵母輔助自溶過(guò)程影響較大的因素，以細(xì)胞死亡率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化各酶輔助酵母自溶的條件，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 酶輔助自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme assisted-autolysis conditions optimization

1.3.5 單酶、雙酶和多酶聯(lián)用助溶能力比較

在正交試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以細(xì)胞死亡率和離心上清液干物質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞壁氨基酸態(tài)氮、總氮、葡聚糖和甘露聚糖等成分的含量，比較并驗(yàn)證單酶、雙酶和三酶聯(lián)用的助溶能力。其中雙酶和多酶聯(lián)用助溶過(guò)程中，加酶順序按酵母細(xì)胞壁由外到內(nèi)的組分相對(duì)應(yīng)的水解酶種類進(jìn)行，加酶時(shí)間間隔為30 min，具體方案見表2。

表2 助溶能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)Table 2 Validation experiments design for assisted-autolysis ability

2 結(jié)果與分析

2.1 面包酵母FX-2酶法助溶單一對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果

不同酶在各自有效作用條件下[甘露聚糖酶（52.5℃、pH 6.0）、木瓜蛋白酶（52.5℃、pH6.0）、β-葡聚糖酶（52.5℃、pH6.0）和蝸牛酶（37℃、pH6.0）]，輔助酵母自溶的效果，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶對(duì)面包酵母FX-2輔助自溶效果的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the assisted-autolysis performance of baker's yeast FX-2

由圖1可知，甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶在面包酵母輔助自溶過(guò)程中均有明顯的作用效果，其中木瓜蛋白酶效果最為顯著（圖1B），與空白組相比，加酶組酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量較高，且細(xì)胞死亡速率明顯加快。甘露聚糖酶（圖1A）和β-葡聚糖酶（圖1C）分別在6 h和10 h左右開始加速酵母自溶，體現(xiàn)在加酶組細(xì)胞死亡率和離心上清液干物質(zhì)含量的提高，其中β-葡聚糖酶發(fā)揮作用的時(shí)間相比較晚，可能是由于前期酵母細(xì)胞壁完整，β-葡聚糖酶較難作用于細(xì)胞壁葡聚糖內(nèi)層造成的。相反，蝸牛酶作用效果較?。▓D1D），在連續(xù)自溶24 h的過(guò)程中，與空白組相比，加酶組細(xì)胞死亡率和離心上清液干物質(zhì)含量均無(wú)明顯提升，這可能是由于酵母細(xì)胞在蝸牛酶的作用環(huán)境中（37℃），溫度壓力小，仍具有較高活性，加之酵母特有的堅(jiān)固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其在友好溫度下具有較強(qiáng)的應(yīng)激抗性。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，可知酵母輔助自溶過(guò)程不僅受外加酶種類的影響，還在很大程度上受溫度的影響。基于此，選擇效果較為明顯的甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶做進(jìn)一步研究。

2.2 面包酵母FX-2輔助自溶條件確定單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甘露聚糖酶助溶單因素試驗(yàn)結(jié)果

在甘露聚糖酶的有效作用條件（即pH5.5，溫度52.5℃）下，研究了酶添加量對(duì)酵母輔助自溶效果的影響見圖2A，由圖2A可知，酶添加量為0.6‰時(shí)，細(xì)胞死亡率相對(duì)較高，效果較好；在酶添加量為0.6‰，溫度52.5℃的條件下，研究了pH對(duì)助溶效果的影響見圖2B，由圖2B可知，pH5.5時(shí)，細(xì)胞死亡率及酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量均較高，表明該pH條件更有利甘露聚糖酶輔助酵母自溶，而pH較低時(shí)（＜5.0），助溶效果差，這可能是由于甘露聚糖酶的活性受到了部分抑制；在酶添加量為0.6‰，pH5.5的條件下，研究了溫度助溶效果的影響見圖2C，由圖2C可知，隨溫度的上升，助溶程度不斷提高，這可能是由于溫度越高，酵母細(xì)胞所受的環(huán)境壓力也越大，其自身壓力應(yīng)激反應(yīng)會(huì)激活胞內(nèi)相關(guān)自溶酶（系），加速細(xì)胞瓦解[1]。而當(dāng)溫度＞55.0℃時(shí)，助溶程度放緩，這可能是由于溫度較高，抑制了酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁甘露聚糖層的水解過(guò)程受到影響，因此選擇55.0℃為最適溫度。

圖2 不同因素對(duì)甘露聚糖酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.2 Effects of different factors on the mannase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.2 木瓜蛋白酶助溶單因素試驗(yàn)結(jié)果

在木瓜蛋白酶有效作用范圍內(nèi)，選擇pH5.5，溫度52.5℃為初始條件，考察了酶添加量對(duì)酵母酶法助溶效果的影響見圖3A，由圖3A可知，在酶添加量為0.4‰時(shí)，細(xì)胞死亡率達(dá)到最大值，酶添加量＞0.4‰時(shí)，離心液干物質(zhì)含量雖有較小幅度提升但變化不大且較為穩(wěn)定，因此選擇0.4‰為最適酶添加量；在酶添加量為0.4‰，溫度52.5℃的條件下，不同pH值對(duì)助溶效果的影響見圖3B，由圖3B可知，pH5.5時(shí)，細(xì)胞死亡率及離心上清液干物質(zhì)含量同時(shí)達(dá)到最高水平，表明該pH條件更有利木瓜蛋白酶的輔助酵母自溶過(guò)程，而pH值較低或較高時(shí)，助溶效果較差；在最適酶添加量0.4‰、最適pH5.5的條件下，研究了溫度對(duì)酵母助溶過(guò)程的影響見圖3C，從圖3C可知，隨溫度的升高，酵母助溶程度也不斷提高，當(dāng)溫度達(dá)到55.0℃時(shí)，酵母細(xì)胞基本全部死亡（細(xì)胞死亡率＞95%），進(jìn)一步說(shuō)明酵母細(xì)胞響應(yīng)高溫壓力會(huì)加速自身降解，隨著溫度的進(jìn)一步升高，自溶酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量仍不斷提高，這是由于酵母死亡后，較高的溫度會(huì)加速細(xì)胞瓦解，如破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，造成壁孔，加速胞內(nèi)物質(zhì)逸出[11]，但高溫劇烈條件，會(huì)影響酵母內(nèi)源自溶酶（系）的作用，抑制部分木瓜蛋白酶的水解活性，并且加大能耗，因此選擇最適溫度為55.0℃。

圖3 不同因素對(duì)木瓜蛋白酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.3 Effects of different factors on the papain assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.2.3 β-葡聚糖酶助溶單因素試驗(yàn)結(jié)果

在β-葡聚糖酶的有效作用范圍內(nèi)，選擇pH5.5，溫度52.5℃為初始條件，考察了酶添加量對(duì)酵母助溶效果的影響見圖4A，由圖4A可知，酶添加量為0.2‰時(shí)，細(xì)胞死亡率和離心液干物質(zhì)含量均相對(duì)較高，助溶效果較好；在酶添加量為0.2‰，溫度52.5℃的條件下，不同pH值對(duì)助溶效果的影響見圖4B，由圖4B可知，當(dāng)pH＞6.0時(shí)，助溶程度明顯較低，說(shuō)明該pH條件不利酵母自身內(nèi)源水解酶（系）及外源β-葡聚糖酶發(fā)揮作用，考慮到自然酵母乳一般呈偏酸性（pH＜6.0），選擇pH 5.5為最適條件；在酶添加量0.2‰，pH 5.5的條件下，研究了溫度對(duì)酵母助溶過(guò)程的影響見圖4C，由圖4C可知，隨溫度的上升，自溶酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量不斷提高，但細(xì)胞死亡率在溫度＞52.5℃時(shí)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在57.5℃時(shí)又出現(xiàn)回升，這充分說(shuō)明較高的溫度（＞52.5℃）會(huì)影響β-葡聚糖酶的活性，減緩酵母細(xì)胞壁水解過(guò)程，降低細(xì)胞死亡率，而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)（＞57.5℃），酵母細(xì)胞難以耐受環(huán)境條件，加速自身瓦解，釋放胞內(nèi)物質(zhì)。綜合考慮，選擇52.5℃為最適溫度。

圖4 不同因素對(duì)β-葡聚糖酶輔助面包酵母自溶效果的影響Fig.4 Effects of different factors on theβ-glucanase assisted-autolysis performance of baker's yeast

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以細(xì)胞死亡率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別按照表1、表2和表3的設(shè)計(jì)進(jìn)行了甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶輔助酵母自溶條件的進(jìn)一步優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表3～表5所示。

由表3可知，甘露聚糖酶助溶條件對(duì)面包酵母死亡率（酶法輔助自溶效率）的影響順序?yàn)镃（溫度）＞B（pH）＞A（酶添加量），細(xì)胞死亡率最高的條件組合是A2B3C2，即酶添加量0.6‰，pH 6.0，溫度55.0℃。在此最佳條件下助溶12 h，細(xì)胞死亡率為98.26%，同時(shí)酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量達(dá)5.47%。由表4可知，木瓜蛋白酶助溶條件對(duì)細(xì)胞死亡率的影響順序?yàn)镃（溫度）＞B（pH）＞A（酶添加量），細(xì)胞死亡率最高的條件組合是A3B2C3，即酶添加量0.6‰，pH 5.5，溫度57.5℃。在此最佳條件下4進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，細(xì)胞死亡率為100%，同時(shí)酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量達(dá)9.21%。由表5可知，β-葡聚糖酶助溶條件對(duì)細(xì)胞死亡率的影響順序?yàn)镃（溫度）＞A（酶添加量）＞B（pH），細(xì)胞死亡率最高的條件組合是A2B3C3，即β-葡聚糖酶添加量0.2‰，pH 6.0，溫度55.0℃。在此最佳條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，細(xì)胞死亡率為97.92%，同時(shí)酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量達(dá)5.18%。結(jié)果表明，木瓜蛋白助溶效果最好，其次是甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶。

表3 甘露聚糖酶輔助自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for mannanase assisted-autolysis conditions optimization

表4 木瓜蛋白酶輔助自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for papain assisted-autolysis conditions optimization

表5 β-葡聚糖酶輔助自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for β-glucanase assisted-autolysis conditions optimization

2.4 單酶、雙酶和多酶聯(lián)用助溶能力比較驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，按照表4設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，助溶10h（單酶助溶12 h，各方案下酵母細(xì)胞死亡率分別為98.26%，100%和97.92%，即接近全部死亡或全部死亡?；诙嗝嘎?lián)用優(yōu)于單酶作用效果，可以縮短助溶時(shí)間，選擇10 h為評(píng)判終點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化助溶工藝），測(cè)定細(xì)胞死亡率及酵母乳離心干物質(zhì)含量，比較不同單酶及復(fù)合酶對(duì)酵母助溶過(guò)程的作用效果，結(jié)果見圖5。

圖5 各方案輔助自溶效果比較Fig.5 Comparison of assisted-autolysis performance of different scheme

由圖5可知，在單酶作用方案中，木瓜蛋白酶（c）的作用效果最好，其次是甘露聚糖酶（a）和β-葡聚糖酶（b），這與正交試驗(yàn)的結(jié)果基本相符。從細(xì)胞死亡率和酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量的高低水平來(lái)看，雙酶（d、e、f）和多酶聯(lián)用（g）方案的助溶效果均優(yōu)于單酶方案。在雙酶方案中，木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶（e）效果最好，其次是甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶（f）和甘露聚糖酶＋β-葡聚糖酶（d）。甘露聚糖酶＋木瓜蛋白酶＋β-葡聚糖酶的三酶聯(lián)用方案（g）助溶效果基本與e方案相當(dāng)，表現(xiàn)在兩方案的細(xì)胞死亡率均達(dá)到100%，其中e方案的離心液干物質(zhì)含量稍高于g方案。因此，選擇雙酶組合e為最優(yōu)方案，即13%酵母乳調(diào)pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃助溶30 min后，調(diào)節(jié)溫度為55 ℃、pH為 6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。該條件下，細(xì)胞死亡率及酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量分別達(dá)100%和9.40%。

為驗(yàn)證優(yōu)化方案的可靠性，收集各助溶方案下的酵母細(xì)胞壁檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見圖6和表6。

圖6 面包酵母輔助自溶細(xì)胞壁檢測(cè)數(shù)據(jù)Fig.6 The cell wall detection data of baker's yeast after assisted-autolysis

表6 面包酵母輔助自溶細(xì)胞壁各組分含量變化Table 6 Content changes of cell wall components in baker's yeast assisted-autolysis%

由圖6和表8可知，方案e條件下，酵母細(xì)胞壁總氮、葡聚糖及甘露聚糖含量均較低，表明該方案下，細(xì)胞壁水解相對(duì)充分，其水解度高達(dá)54.41%，酵母自溶率理想；而氨氮含量為1.45%，相對(duì)較高，進(jìn)一步說(shuō)明酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)層水解嚴(yán)重，酵母溶解程度提高，這與圖5中結(jié)果相符，驗(yàn)證了方案e的可靠性。

3 結(jié)論

本項(xiàng)目主要研究了外源酶添加對(duì)面包酵母（Saccharomycescerevisiae）FX-2輔助自溶過(guò)程的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定不同外源酶輔助酵母自溶效率最高的條件，效果最好的為木瓜蛋白酶：酶添加量為0.6‰，pH 5.5，助溶溫度57.5℃。該條件下，助溶12 h，細(xì)胞死亡率達(dá)100%，同時(shí)酵母乳離心上清液干物質(zhì)含量也高達(dá)9.21%。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了單酶、雙酶和多酶聯(lián)用的助溶能力，獲得條件友好的面包酵母酶法助溶工藝：13%酵母乳調(diào)pH至5.5，添加0.6‰木瓜蛋白酶，于57.5℃條件下助溶30min后，調(diào)節(jié)溫度為55℃、pH為6.0、添加0.2‰β-葡聚糖酶，助溶至10 h。該工藝下，細(xì)胞死亡率及離心上清液干物質(zhì)含量分別為100%和9.40%，同時(shí)細(xì)胞壁水解程度高達(dá)54.41%，進(jìn)一步優(yōu)化了面包酵母酶法助溶過(guò)程，縮短助溶時(shí)間。

本研究開發(fā)的面包酵母FX-2酶法助溶工藝，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，助溶效率高，對(duì)酵母自溶工藝的優(yōu)化及高品質(zhì)酵母抽提物的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，且應(yīng)用前景良好。