寧安鳳，董藝超，朱旗，毛麗梅，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)院，佳木斯 154007；3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；4.石家莊第六醫(yī)院，石家莊 050051)

稽留流產(chǎn)是一種特殊性的自然流產(chǎn)，又稱過期流產(chǎn)或死胎不下，是指妊娠20周之前胚胎或胎兒已死亡并滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出者[1]。近年來稽留流產(chǎn)的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，其絕對(duì)數(shù)逐年增加[2]。目前已知的病因中有遺傳性因素、感染性疾病、免疫功能異常、內(nèi)分泌失調(diào)以及孕婦年齡等[3-7]。盡管國內(nèi)外關(guān)于稽留流產(chǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道不少，但其發(fā)病機(jī)制迄今未明。

MicroRNA(miRNA)是一類長度為20～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，普遍存在于各種動(dòng)植物體內(nèi)，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[8-9]。MiR-30d是一個(gè)在生殖、發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用的基因[10-12]。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在大鼠胚胎植入時(shí)表達(dá)上調(diào)[13]。Cai等[10]的研究也顯示miR-30d表達(dá)上調(diào)有助于子宮內(nèi)膜接受態(tài)的形成，其表達(dá)下調(diào)可以破壞子宮內(nèi)膜接受態(tài)和抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在胚胎植入過程中，母體子宮內(nèi)膜miR-30d表達(dá)升高可以增強(qiáng)小鼠胚胎粘附能力[14]。這些研究結(jié)果提示miR-30d過表達(dá)有助于胚胎植入的發(fā)生。胚胎植入異常是引起自然流產(chǎn)的原因之一，miR-30d是否與稽留流產(chǎn)發(fā)生相關(guān)尚未見報(bào)道。本研究通過定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析了miR-30d在人稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中的表達(dá)模式，并利用原位雜交檢測(cè)了miR-30d的表達(dá)定位，為探索miR-30d在稽留流產(chǎn)中的作用奠定一定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2013年1月至2014年12月于石家莊第六醫(yī)院治療的80例稽留流產(chǎn)患者及同期該院1∶1匹配的正常人工流產(chǎn)孕婦為研究對(duì)象，分別為稽留流產(chǎn)組(80例)和對(duì)照組(80例)，收集絨毛組織。年齡20～40歲，孕周8～12 w。由于年齡是引起稽留流產(chǎn)的一個(gè)危險(xiǎn)因素，將稽留流產(chǎn)組按照年齡不同分為4個(gè)亞組：年齡≤25歲組(Y≤25)、26～30歲組(Y 26～30)、31～35歲組(Y 31～35)、≥36歲組(Y≥36)。對(duì)照組根據(jù)稽留流產(chǎn)組的年齡進(jìn)行1∶1匹配，每亞組稽留流產(chǎn)組和對(duì)照組各10例。排除染色體異常、生殖器官異常、感染性疾病、免疫功能異常和內(nèi)分泌失調(diào)?；袅鳟a(chǎn)的診斷依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[1]。

二、方法

1.主要試劑： TRIzol reagent(Invitrogen，美國)、M-MLV reverse transcriptase(Promega，美國)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、FastStart Univel SYBR Green Master以及miRNA雜交液和地高辛抗體(Roche，德國)、miR-30d 地高辛探針(上海生工生物工程公司)、miR-30d qRT-PCR Primer Set(廣州RIBBIO公司)。

2.總RNA的提?。豪肨RIzol一步法提取絨毛組織總RNA，具體步驟如下：取50～100 mg絨毛組織加入1 ml TRIzol，先用滅菌剪刀將組織剪碎，再用勻漿器破碎組織，轉(zhuǎn)入Eppdoff管，加入0.2 ml氯仿充分混勻，室溫靜置2～3 min，4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清至新的Eppdoff管，加入2倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7 500 rpm離心5 min，棄掉乙醇，重復(fù)2次，沉淀室溫干燥，加入無核酸酶水溶解。

3.qRT-PCR：取1 μg Total RNA、M-MLV reverse transcriptase，miR-30d反轉(zhuǎn)錄引物、RNase inhibitor、dNTP mixture、10×buffer，按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μl。反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃ 1 h，85℃ 5 min。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，加入FastStart Universal SYBR Green Maste和miR-30d PCR引物(正向引物：5′-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG-3′；反向引物：5′-ACAGACAGCATCACTCA-3′)，在ABI Prism 7500 Sequence Detection System進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，然后95℃ 15 s和60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。U6作為內(nèi)參(正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)，用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品至少3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

4.原位雜交：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇分級(jí)水化后用4%多聚甲醛后固定，蛋白酶K處理，然后置于預(yù)雜交液(50%去離子甲酰胺，5×SSC，120 μg/ml鮭魚精DNA)中，于42℃預(yù)雜交2 h，將地高辛標(biāo)記的miR30d探針(5′-DIG-ctTccaGtcgGggAtgtTtaCa-3′)以400 ng/ml的濃度加入預(yù)雜交液中，40℃雜交過夜。2×SSC緩沖液中洗滌以除去非特異性結(jié)合的探針。用0.5% 封閉劑室溫孵育1 h，加入抗地高辛抗體孵育2 h，用NBT/BCIP顯色。清水終止顯色后封片。陰性對(duì)照是用地高辛標(biāo)記的LNA-scrambled 探針進(jìn)行雜交。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料比較

稽留流產(chǎn)組和對(duì)照組患者的一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

表1 兩組患者一般資料比較 (x-±s)

二、 miR-30d在稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)

1.稽留流產(chǎn)組和對(duì)照組中miR-30d的表達(dá)：將兩組患者絨毛組織樣本進(jìn)行檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)miR-30d在稽留流產(chǎn)組絨毛組織中的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但兩組間尚無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-30d在兩組患者絨毛組織中的表達(dá)

2.miR-30d在稽留流產(chǎn)組不同年齡亞組絨毛組織中的表達(dá)：qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-30d在Y≤25組患者絨毛組織中表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，在Y 26～30組患者絨毛組織中表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，在Y 31～35組患者絨毛組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，在Y≥36組患者絨毛組織中表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)(圖2)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 不同年齡亞組與對(duì)照組患者絨毛組織中miR-30d的表達(dá)

3.miR-30d在不同年齡段稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中表達(dá)的個(gè)體化差異：對(duì)miR-30d在不同年齡段稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)水平與1∶1匹配的對(duì)照組逐個(gè)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在Y≤25組中，70%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；在Y 26～30組，100%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；在Y 31～35組，30%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，20%患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，其余患者miR-30d表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)；在Y≥36組，30%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，40%患者絨毛組織中miR-30d表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，其余患者miR-30d的表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)(圖3)。

三、miR-30d在絨毛組織中的定位

由于miR-30d在30歲以下稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中表達(dá)為下調(diào)，30歲以上患者沒有明顯趨勢(shì)，因此，我們將兩組患者以30歲為界分成兩個(gè)亞組(Y≤30和Y≥31)，利用原位雜交方法分析miR-30d的表達(dá)定位。檢測(cè)結(jié)果顯示，在Y≤30的稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，miR-30d的陽性著色主要見于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，且其陽性信號(hào)強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組；在Y≥31的稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，miR-30d的陽性信號(hào)主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，和對(duì)照組的信號(hào)強(qiáng)度未見明顯差異(圖4)。

注：與匹配的對(duì)照組比較，**P<0.01圖3 不同年齡段稽留流產(chǎn)絨毛組織中miR-30d表達(dá)的個(gè)體化差異

圖4 原位雜交檢測(cè)miR-30d在絨毛組織中的定位(×100，箭頭示miR-30d陽性信號(hào))

討 論

MiRNAs與稽留流產(chǎn)關(guān)系的研究剛剛起步，在NCBI、PubMed上搜索僅見一篇報(bào)道，miR-575異常表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生參與稽留流產(chǎn)的發(fā)生[15]。國內(nèi)植枝福等[16]報(bào)道m(xù)iR-518在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織及血清中的表達(dá)明顯升高。目前，國內(nèi)外關(guān)于miRNAs與稽留流產(chǎn)關(guān)系的報(bào)道不多。由此可見，miRNAs與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性遠(yuǎn)未闡述清楚。

我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在大鼠胚胎植入中表達(dá)顯著上調(diào)[13]，而胚胎植入的異常是引起稽留流產(chǎn)的一個(gè)重要原因，因此，本研究選擇miR-30d作為研究對(duì)象，利用已經(jīng)收集的稽留流產(chǎn)絨毛組織分析了miR-30d的表達(dá)模式。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-30d在Y≤25和Y 26～30組，無論是總體表達(dá)趨勢(shì)還是個(gè)體化分析均顯著下調(diào)；在Y 31～35組，總體趨勢(shì)表達(dá)上調(diào)，個(gè)體化分析沒有明顯規(guī)律；在Y≥36組，總體趨勢(shì)和個(gè)體化分析均未見明顯差異。MiR-30d在稽留流產(chǎn)患者30歲前后的變化趨勢(shì)不一致可能主要是由于隨著年齡的增長基因發(fā)生改變[17]，人的個(gè)體化差異就越大，不容易發(fā)現(xiàn)一致性規(guī)律。植枝福等[16]利用qRT-PCR檢測(cè)稽留流產(chǎn)患者胎盤和血液miR-518表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其顯著上調(diào)，推測(cè)其可能與稽留流產(chǎn)的發(fā)病相關(guān)。miRNA的表達(dá)變化在一定程度上可能反映了其與疾病的相關(guān)性。MiR-30d在稽留流產(chǎn)患者胎盤組織中表達(dá)下調(diào)，而其在胚胎植入時(shí)表達(dá)上調(diào)，我們推測(cè)miR-30d表達(dá)下調(diào)可能引起胚胎植入異常，不利于胎盤的形成，進(jìn)而引起稽留流產(chǎn)。

原位雜交結(jié)果顯示miR-30d主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞位于絨毛最表層，直接與母體血液相接觸，是母體血液與胎兒血液物質(zhì)交換的前沿，構(gòu)成母胎循環(huán)的屏障，保護(hù)胎兒免受母體有毒有害物質(zhì)的損傷[18]。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞除具有活躍的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)物質(zhì)的功能外，還具有分泌大量對(duì)胚胎發(fā)育和維持妊娠所必需的多種激素和細(xì)胞因子的作用，保護(hù)胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的損傷，有利于胎兒在宮腔內(nèi)生長發(fā)育[19-22]。MiR-30d在小于30歲的稽留流產(chǎn)患者合體滋養(yǎng)層的陽性信號(hào)弱于正常妊娠者，這提示miR-30d低表達(dá)可能不利于滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)揮正常功能，影響胎兒發(fā)育，進(jìn)而引起胚胎停育和稽留流產(chǎn)。

綜上所述，miR-30d在小于30歲稽留流產(chǎn)患者胎盤合體滋養(yǎng)層中表達(dá)下調(diào)，可能不利于胎盤的發(fā)育，這可能是引起稽留流產(chǎn)的原因之一。對(duì)miR-30d在稽留流產(chǎn)中表達(dá)模式的研究將為深入探討miRNAs在稽留流產(chǎn)中的作用提供有價(jià)值的資料，也可能為稽留流產(chǎn)的早期預(yù)警提供有潛在價(jià)值的分子靶標(biāo)。