劉 鵬，李鵬昊，張 翼，朱巧燕，李向東，黃玉欣，田克恭

（國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

豬支原體肺炎是一種豬慢性呼吸道疾病，病原是豬肺炎支原體 （Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）［1］。豬支原體肺炎的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難和食欲減退等，患病豬往往生長(zhǎng)緩慢，且常誘發(fā)其他病原感染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （PRRSV）、豬2型圓環(huán)病毒（PCV2）等，增加了豬病診斷和防控的難度［2-3］。該種疾病具有流行范圍廣、發(fā)病率高、凈化難度大的特點(diǎn)，對(duì)國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗免疫是該病的主要防控手段。

Mhp具有完整的糖酵解途徑，能代謝葡萄糖產(chǎn)酸，因此，可利用酚紅作為指示劑，通過(guò)顏色變化來(lái)反映其生長(zhǎng)情況。其免疫原性的高低，目前多通過(guò)變色單位CCU對(duì)其滴度進(jìn)行定量來(lái)反映［4］。Mhp生長(zhǎng)條件苛刻，其常規(guī)培養(yǎng)多采用改良KM2或其衍生培養(yǎng)基，培養(yǎng)滴度可達(dá) 1×108CCU/mL［5］。有研究者通過(guò)優(yōu)化Mhp的培養(yǎng)方法，使其CCU滴度提高至 1×109CCU/mL［6］。此外，一些中間代謝物如丙酮酸的添加對(duì)Mhp的生長(zhǎng)也具有一定的促進(jìn)作用［7］。Mhp屬于兼性厭氧型微生物，無(wú)完整細(xì)胞壁，對(duì)活性氧（ROS）及剪切力極為敏感；其底物代謝相關(guān)膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及前體合成相關(guān)酶促反應(yīng)途徑不完善，不能通過(guò)氧化磷酸化為其生長(zhǎng)提供能量來(lái)源，因此，規(guī)模化培養(yǎng)難度較大［8］。朱秀同等［9］通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間、pH值、攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量等條件，最終實(shí)現(xiàn)在500 L發(fā)酵規(guī)模條件下培養(yǎng)滴度達(dá)到1×109CCU/mL，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。國(guó)外對(duì)Mhp更多側(cè)重于其感染機(jī)制及相關(guān)基礎(chǔ)理論的研究，根據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，Mhp常規(guī)培養(yǎng)CCU水平可達(dá)到 1×109CCU/mL［10］。

該研究首先確定了Mhp HN0613株的最佳培養(yǎng)代次及復(fù)蘇條件，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選得到最優(yōu)基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝條件；然后進(jìn)行15 L規(guī)模的發(fā)酵工藝放大與優(yōu)化，對(duì)比不同接種百分比、培養(yǎng)基pH值、攪拌和通氣等工藝參變量對(duì)Mhp HN0613株發(fā)酵的影響，系統(tǒng)優(yōu)化后確定該規(guī)模條件下的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)與過(guò)程控制路線；最后進(jìn)行700 L規(guī)模條件的發(fā)酵工藝放大，確定規(guī)?；陌l(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)路線。該研究首次采用了pH值回調(diào)與平衡kLa相結(jié)合的Mhp發(fā)酵工藝路線，對(duì)Mhp的規(guī)模化培養(yǎng)及疫苗產(chǎn)業(yè)化研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

豬血清購(gòu)自Gibco公司，腦心浸液（BHI）、PPLO肉湯均購(gòu)自BD公司，酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司，注射用青霉素鈉購(gòu)自華北制藥股份有限公司；Mhp抗體檢測(cè)試劑盒及豬繁殖與呼吸綜合征抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，15 L發(fā)酵罐購(gòu)自賽多利斯貿(mào)易有限公司，700 L發(fā)酵設(shè)備購(gòu)自上海東富龍科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Mhp HN0613株由普萊柯生物工程股份有限公司分離保藏［11］，攻毒所用Mhp YC株組織毒由普萊柯生物工程股份有限公司制備保藏；豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原陰性及Mhp血清抗體陰性仔豬20頭（14～21日齡），日本大耳白兔（體重1.0～1.5 kg）20只，由普萊柯生物工程股份有限公司國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心動(dòng)物房提供。

1.3 Mhp HN0613株培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝優(yōu)化

1.3.1 種子復(fù)蘇培養(yǎng)：Mhp HN0613株種子復(fù)蘇培養(yǎng)基參考豬肺炎支原體Friis培養(yǎng)基配制［11］。活化Mhp HN0613株凍干菌，首先用1 mL Friis培養(yǎng)基將其溶解，然后按10%比例接種靜置瓶，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每天觀察顏色變化，并對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行檢測(cè)；待培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色時(shí)（pH值為7.0左右），進(jìn)行接種或傳代培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝：發(fā)酵培養(yǎng)基采用經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基配方（初始pH值為7.6），一級(jí)種子接種后靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期（pH值為7.0左右），接種15 L發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，其中，帶壓封閉培養(yǎng)過(guò)程壓力設(shè)置為100 m bar；700 L規(guī)模發(fā)酵共需進(jìn)行三級(jí)種子培養(yǎng)，一級(jí)種子為靜置瓶培養(yǎng)，二級(jí)種子采用15 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，采取間歇通氣攪拌的培養(yǎng)方式，待pH值降低至7.0左右時(shí)轉(zhuǎn)接50 L發(fā)酵罐作為三級(jí)種子進(jìn)行培養(yǎng)，最后接種700 L發(fā)酵罐開始發(fā)酵。

表1 不同代次對(duì)Mhp HN0613株培養(yǎng)滴度的影響CCU/mL

表2 種子復(fù)蘇時(shí)間對(duì)Mhp HN0613株培養(yǎng)滴度的影響CCU/mL

1.4 豬肺炎支原體培養(yǎng)滴度檢測(cè)方法

采用10倍稀釋法，即1.8 mL Friis培養(yǎng)基添加200 μL菌種樣品倍比稀釋。取菌種樣品在無(wú)菌條件下依次按照1∶10比例進(jìn)行倍比稀釋，稀釋梯度達(dá)到 10-1、10-2······10-11， 以 Friis 培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每日觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化，與空白對(duì)照比較顏色變黃計(jì)為一個(gè)滴度，即1×10 CCU/mL，未完全變色則計(jì)為半個(gè)滴度。

1.5 Mhp HN0613株滅活疫苗制備與效力評(píng)價(jià)

1.5.1 Mhp HN0613株滅活疫苗制備：用自制的以卡波姆為基礎(chǔ)的水性佐劑，按10%的比例與Mhp抗原充分?jǐn)嚢杈鶆?，制備Mhp滅活疫苗，Mhp抗原由3批次700 L規(guī)模Mhp HN0613株發(fā)酵所得，抗原含量為 4×108CCU/mL［12］。

1.5.2 Mhp HN0613株滅活疫苗免疫豬效力評(píng)價(jià)：將20頭合格實(shí)驗(yàn)仔豬隨機(jī)分成4組，每組5頭；其中，第1～3組分別免疫3批次700 L發(fā)酵抗原所配滅活疫苗，第4組未免疫。疫苗免疫采用頸部肌肉注射的方法，劑量為2 mL/頭，免疫后35 d用Mhp YC株組織強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，每頭豬氣管注射10 mL，含 100 MID（最小發(fā)病劑量）；攻毒后 28 d對(duì)實(shí)驗(yàn)豬進(jìn)行剖殺，并按28分法進(jìn)行病變?cè)u(píng)分，計(jì)算肺炎病變減少率；肺炎病變減少率=（攻毒對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬肺炎病變平均得分-免疫組實(shí)驗(yàn)豬肺炎病變平均得分）/攻毒對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬肺炎病變平均得分×100%。

1.5.3 Mhp HN0613株滅活疫苗免疫兔效力評(píng)價(jià)：將20只日本大耳白兔隨機(jī)分成4組，第1～3組分別腿部肌肉注射3批自制Mhp滅活疫苗，劑量為0.5 mL/只，第4組不接種作為空白對(duì)照；免疫后35 d采血，用IHA法檢測(cè)兔血清Mhp抗體效價(jià)，抗體效價(jià)＞1∶20即判為陽(yáng)性，試驗(yàn)組結(jié)果大于4/5為合格，具體參照劉志南等［13］報(bào)道的IHA檢測(cè)Mhp抗體方法進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

正交試驗(yàn)結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活化與復(fù)蘇培養(yǎng)

種子活力對(duì)接種后菌體生長(zhǎng)狀態(tài)有著至關(guān)重要的作用，為了使Mhp HN0613株保持最佳接種活性，設(shè)計(jì)了2組平行試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比不同菌株代次及種子復(fù)蘇時(shí)間，并根據(jù)CCU這一反映菌體生長(zhǎng)活性的重要指標(biāo)，考查其對(duì)Mhp HN0613株培養(yǎng)的影響。

由表1可知，Mhp HN0613株F11代較其他代次CCU水平高，可達(dá)1×109CCU/mL，為最佳活力代次。使用該代次菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，不同時(shí)間取樣進(jìn)行CCU水平檢測(cè)。由表2可知，Mhp HN0613株F11代種子在復(fù)蘇72 h后pH值降為7.0左右，CCU水平達(dá)到最高，為1×109CCU/mL。該試驗(yàn)最終確定了Mhp HN0613株最佳種子代次及復(fù)蘇工藝條件，為后續(xù)發(fā)酵接種時(shí)機(jī)選取提供了依據(jù)。

2.2 靜置培養(yǎng)篩選Mhp HN0613株最佳培養(yǎng)基配方與工藝條件

Mhp生長(zhǎng)條件要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)滴度的高低受培養(yǎng)工藝條件影響較大，為了確定Mhp HN0613株最適培養(yǎng)條件與工藝，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)考查初始葡萄糖添加量、初始培養(yǎng)基pH值、接種百分比和豬血清添加量對(duì)Mhp HN0613株培養(yǎng)的影響。

表3 Mhp HN0613 株 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 Mhp HN0613株靜置瓶培養(yǎng)CCU檢測(cè)結(jié)果

Mhp HN0613株F11代種子復(fù)蘇72 h（pH值降至7.0左右）后接種靜置瓶進(jìn)行靜置培養(yǎng)，根據(jù)SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3中正交試驗(yàn)的分析結(jié)果，培養(yǎng)體系中，2%的初始葡萄糖添加量、8%接種百分比、初始培養(yǎng)基pH值7.6、15%豬血清添加量為Mhp HN0613株的最適培養(yǎng)條件；其中，葡萄糖添加量對(duì)Mhp HN0613株培養(yǎng)結(jié)果影響最大，但所有試驗(yàn)因素影響均不顯著。在試驗(yàn)所得最適培養(yǎng)條件下，對(duì)Mhp HN0613株進(jìn)行靜置培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定其CCU水平。由圖1可知，Mhp HN0613株在培養(yǎng)120 h時(shí)滴度水平達(dá)到最高值，為5×109CCU/mL。該試驗(yàn)為Mhp HN0613株工藝放大試驗(yàn)確定了最佳的培養(yǎng)基配比。

圖2 Mhp HN0613株15 L發(fā)酵工藝優(yōu)化及CCU檢測(cè)結(jié)果

2.3 平衡kLa聯(lián)動(dòng)pH值回調(diào)工藝技術(shù)的建立

Mhp為兼性厭氧型無(wú)細(xì)胞壁病原微生物，生長(zhǎng)前期ROS需求較低，該試驗(yàn)根據(jù)Mhp HN0613菌株的特性，在15 L規(guī)模發(fā)酵時(shí)采用平衡溶氧傳質(zhì)系數(shù)kLa（前期帶壓封閉培養(yǎng)、后期間歇通氣攪拌）的工藝策略，并對(duì)ROS、接種百分比、帶壓封閉時(shí)長(zhǎng)及機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速等發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行篩選。由于Mhp對(duì)ROS較為敏感，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了較低水平的通氣條件，分別為 100、150、200 L/h；攪拌轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為 200、300、400 r/min；接種百分比分別為4%、8%、12%。

表4 Mhp HN0613株50 L種子培養(yǎng)滴度變化CCU/mL

表5 3批Mhp疫苗免疫兔效力評(píng)價(jià)

通過(guò)單因素考查對(duì)比發(fā)現(xiàn)，通氣量100 L/h、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min和8%接種百分比條件最有利于Mhp HN0613株15 L發(fā)酵培養(yǎng)（見(jiàn)圖2A）；經(jīng)工藝調(diào)整對(duì)比，最終將其確定為Mhp HN0613株發(fā)酵最優(yōu)基本參數(shù)。Mhp發(fā)酵周期較長(zhǎng)，考慮到發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH值變化及Mhp HN0613株對(duì)底物代謝的利用率，試驗(yàn)采取在一定培養(yǎng)階段對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行回調(diào)的策略，并系統(tǒng)優(yōu)化了pH值回調(diào)時(shí)機(jī)與參數(shù)，首創(chuàng)平衡kLa聯(lián)動(dòng)pH值回調(diào)的工藝技術(shù)路線。此外，優(yōu)化后發(fā)酵罐攪拌結(jié)構(gòu)類型由六直葉平葉渦輪改為推進(jìn)式葉輪，在相同葉尖線速度的條件下降低了葉輪對(duì)菌體的剪切作用力。在該工藝條件下，Mhp HN0613株15 L發(fā)酵CCU水平最高可達(dá)1×1010CCU/mL，較優(yōu)化前提高了10倍，且培養(yǎng)周期較工藝優(yōu)化前縮短了2～3 d（見(jiàn)圖 2 B）。

2.4 Mhp HN0613株700 L高密度發(fā)酵工藝放大

Mhp HN0613株放大發(fā)酵需進(jìn)行三級(jí)種子培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)種子在對(duì)數(shù)期中后期（CCU達(dá)到最高值的時(shí)間點(diǎn)）接種至50 L種子罐，配合間歇通氣攪拌工藝?yán)^續(xù)培養(yǎng)；取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行CCU檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，50 L發(fā)酵種子CCU水平在培養(yǎng)60 h后 （pH值為7.0左右）達(dá)到最高值，以該點(diǎn)作為700 L發(fā)酵移種最佳操作時(shí)間節(jié)點(diǎn)。Mhp HN0613株700 L規(guī)?；囵B(yǎng)同15 L發(fā)酵優(yōu)化后工藝技術(shù)路線進(jìn)行，取不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行CCU檢測(cè)。由圖3可知，CCU水平在培養(yǎng)50 h左右 （pH值降至 6.7左右）達(dá)到最高值，為5×109CCU/mL，最高批次培養(yǎng)滴度可達(dá)1×1010CCU/mL，實(shí)現(xiàn)了Mhp HN0613株高密度發(fā)酵工藝技術(shù)平臺(tái)的建立。

2.5 Mhp HN0613株700 L發(fā)酵抗原對(duì)動(dòng)物免疫效力評(píng)價(jià)結(jié)果

用3批700 L發(fā)酵抗原制備Mhp滅活疫苗對(duì)兔進(jìn)行免疫，免疫后35 d采血，用IHA法測(cè)定血清抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，第1～3組免疫兔血清抗體效價(jià)均不低于1∶40，最高可達(dá)1∶160，3組結(jié)果判定均為5/5陽(yáng)性，對(duì)照組抗體效價(jià)均小于1∶5。將3批Mhp滅活疫苗對(duì)合格實(shí)驗(yàn)仔豬進(jìn)行免疫，免疫后35 d對(duì)實(shí)驗(yàn)仔豬進(jìn)行攻毒，攻毒后28 d進(jìn)行剖殺，取出肺臟，按28分法對(duì)實(shí)驗(yàn)豬的肺病變 （“肉樣變”“胰樣變”）進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算肺炎病變減少率。由表6可知，免疫組實(shí)驗(yàn)仔豬肺炎減少率均高于80%，臨床觀察精神及食欲未見(jiàn)異常，攻毒對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬均觀察到有典型的“肉變樣”或“胰變樣”，表明試驗(yàn)所用Mhp滅活疫苗對(duì)仔豬具有較好的免疫保護(hù)效果。

3 討論

圖3 Mhp HN0613株700 L發(fā)酵CCU檢測(cè)結(jié)果

表6 3批Mhp疫苗免疫豬效力評(píng)價(jià)

影響Mhp生長(zhǎng)的因素較多，如菌株活力、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等，在同一菌株不同代次之間其活性可能存在著較大的差別。該研究首先確定了Mhp HN0613株的最佳活力種子代次及復(fù)蘇培養(yǎng)條件，根據(jù)CCU水平達(dá)到最高值的時(shí)間最終確定其復(fù)蘇培養(yǎng)周期為72 h。對(duì)于Mhp的培養(yǎng)，一般需要較高含量的血清來(lái)為細(xì)胞生長(zhǎng)提供氨基酸、維生素、脂肪酸、膽固醇及生長(zhǎng)因子等物質(zhì)。該研究通過(guò)對(duì)Mhp HN0613株基本培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化篩選，使其在血清濃度為10%～15%的條件下培養(yǎng)滴度達(dá)到1×109～1×1010CCU/mL。近來(lái)有研究者制備出一種Mhp培養(yǎng)基，可實(shí)現(xiàn)在8%豬血清含量條件下CCU水平達(dá)到1×109CCU/mL，在一定程度上降低了Mhp的培養(yǎng)成本［14］。但血清濃度的降低可能導(dǎo)致Mhp的培養(yǎng)周期延長(zhǎng)，滴度達(dá)到最高值后下降較快，收獲pH值范圍較窄，增加了培養(yǎng)的難度［15］。

Mhp屬于兼性厭氧型微生物，對(duì)ROS需求量少且對(duì)機(jī)械攪拌剪切較為敏感，其大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)一般在較低通氣和攪拌轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行；有研究者在對(duì)Mhp 168株的發(fā)酵培養(yǎng)工藝研究中，將接種后培養(yǎng)基pH值調(diào)整為7.5左右，設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速140 r/min，其前期培養(yǎng)過(guò)程中ROS及pH值均無(wú)明顯變化，后期培養(yǎng)采用間歇通氣及反饋補(bǔ)堿的方法維持培養(yǎng)體系ROS水平及pH值恒定，最終獲得了較高的培養(yǎng)滴度水平［16］。該研究在對(duì)Mhp HN0613株15 L發(fā)酵工藝優(yōu)化中同樣發(fā)現(xiàn)，低水平的間歇通氣及攪拌條件（通氣量100 L/h，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min）更有利于菌體發(fā)酵培養(yǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是滅活疫苗抗原發(fā)酵的常用方式，該法往往能夠在一定程度上提高菌體密度，延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期［17］；但對(duì)于 Mhp HN0613 株發(fā)酵，該研究通過(guò)15 L發(fā)酵工藝條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)補(bǔ)料培養(yǎng)并不能提高其培養(yǎng)滴度，分析可能是由于所用培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較為豐富，無(wú)需通過(guò)補(bǔ)料來(lái)為菌體后期生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)元素。因此，考慮到Mhp HN0613株對(duì)培養(yǎng)基底物的代謝利用率，該研究采取在菌體培養(yǎng)后期進(jìn)行pH值回調(diào)的工藝策略，以期為菌體生長(zhǎng)提供更為有利的環(huán)境條件，提高菌體生長(zhǎng)密度與滴度水平。

綜合Mhp發(fā)酵過(guò)程中的影響因素，該研究創(chuàng)新性地采用平衡kLa聯(lián)動(dòng)pH值回調(diào)的工藝策略，并通過(guò)條件優(yōu)化篩選，最終形成了穩(wěn)定的Mhp HN0613株規(guī)?；l(fā)酵工藝技術(shù)路線，700 L發(fā)酵CCU水平最高可達(dá)1×1010CCU/mL，比國(guó)內(nèi)發(fā)酵水平高出5～10倍；此外，該工藝條件下MhpHN0613株發(fā)酵周期較優(yōu)化前縮短了2～3 d，且由該工藝生產(chǎn)的抗原制備滅活疫苗對(duì)豬具有較好的免疫保護(hù)效果。該研究為Mhp疫苗規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。