伍 鋼 ，鄭文亞 ，肖 亮 ，ABDUL-RAHIMBAKARMATAKA，ASMAKOMBOHAJI，彭侃霖 ，劉 犇

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.宜春市袁州區(qū)畜牧水產(chǎn)局，江西 宜春 336000）

布魯菌病是由布魯菌引起的慢性傳染病。在牲畜中，布魯菌病患病羊為最主要的傳染源，其次為患有該病的牛和豬。公畜感染該病后可能引起睪丸炎和附睪炎，大多數(shù)布魯菌病患病母畜會出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)和死產(chǎn)［1］。當布魯菌在絨毛膜上皮細胞中增殖時，在懷孕母羊的胎盤中發(fā)生炎癥，導(dǎo)致絨毛慢慢壞死，并且胎兒胎盤和母體胎盤逐漸分離，使得流產(chǎn)母畜的子宮內(nèi)膜可能還會發(fā)生更嚴重的炎癥［2-3］。研究表明，布魯菌導(dǎo)致動物患病與以下2個機制相關(guān)：一是被寄生的吞噬細胞的凋亡過程會被布魯菌脂多糖的O鏈所抑制，導(dǎo)致宿主不能夠檢測到它的存在；其次，通常吞噬細菌的吞噬體會與溶酶體融合，使細菌被消化，達到滅菌的目的，但布魯菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)會阻止這一過程的發(fā)生。上述發(fā)病機制給該病的防治造成一定的困難［4］。

布魯菌病屬于傳染類疾病，當養(yǎng)殖場中有一只羊患病，病菌就很快會大面積的傳播，如果母羊處在妊娠期，就會導(dǎo)致其流產(chǎn)，給廣大養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟損失。萍鄉(xiāng)市某羊場妊娠母羊散發(fā)流產(chǎn)，少數(shù)未孕母羊久配不孕，并沒有發(fā)現(xiàn)患有睪丸炎的公羊。此前，該羊場未對羊群進行布魯菌病的免疫。通過虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測該羊場山羊是否感染布魯菌病，旨在為該羊場布魯菌病的凈化工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

在江西省萍鄉(xiāng)市某羊場隨機選取100頭山羊，騎式方式保定，頸靜脈采血 5 mL，將血液在室溫下放置約1 h，然后在低速臺式離心機中以3 000 r/min離心20 min，之后將淡黃色透明液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，并儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

虎紅平板凝集抗原、標準陽性血清和陰性血清，試管凝集抗原、標準陽性血清和陰性血清均購自中國獸藥監(jiān)察所；苯酚等其他化學(xué)試劑由宜春學(xué)院肉牛（羊）疾病控制實驗室提供。

1.3 虎紅平板凝集試驗（RBPT）

取潔凈玻璃板，先用無水乙醇噴灑，再進行火焰灼燒滅菌，待冷卻后用滅菌蒸餾水進行沖洗，用記號筆在玻璃板上畫2 cm×2 cm的小方格，在左下角寫上相應(yīng)的耳標號。按診斷試劑盒說明書用滅菌生理鹽水進行標準陽性血清和陰性血清的稀釋，稀釋后各取30 μL滴加在玻璃板上，同時，將30 μL測試血清移液到對應(yīng)于玻璃板上耳標號的小方框中，滴加30 μL抗原，并使用槍頭充分攪勻，反應(yīng)4 min后記錄結(jié)果。依據(jù)說明書上的評判標準進行結(jié)果的判讀并記錄，標準陰性血清對照呈現(xiàn)粉紅色、均勻、透明，無凝集顆粒；標準陽性血清對照呈點狀或線狀，呈淡紅色—粉紅色—深紅色界限分明，用肉眼可以看到明顯的凝集顆粒。參照標準陰、陽血清，受檢血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)與標準陽性血清相同現(xiàn)象的判為陽性（+），出現(xiàn)與標準陰性血清相同現(xiàn)象的則判為陰性（－）。

1.4 試管凝集試驗（SAT）

檢測對象為RBPT檢測結(jié)果呈陽性的血清。按照說明書制作比濁對照管并進行陰性、陽性和待測血清的稀釋，做 5 個稀釋度（1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200），依次記為 1、2、3、4、5 號管；按說明書要求對抗原進行1∶20的稀釋，之后將0.5 mL稀釋好的抗原分別加入已稀釋好的各血清管中，接著反復(fù)吹打混合均勻；放置在37℃恒溫箱反應(yīng)22 h后取出，在室溫下靜置2 h，最后進行結(jié)果的判讀，按照比濁管的渾濁度和對照組的凝集沉淀情況進行判斷。強陽性記錄為“++++”：抗體完全凝集，在試管底部有大量固體物質(zhì)，上層液體的清亮度為100%；抗體基本凝集記錄為“+++”：試管最底層有較多的沉淀物，上層的液體清亮度為75%；抗體凝集較明顯記錄為“++”：底層固體物質(zhì)較少，上層的液體清亮度為50%；弱陽性記錄為“+”：底部沉淀物很少，液體清亮度為25%；陰性記錄為“-”：管底部沒有沉淀物，液體清亮度為0%。參考比濁對照管和標準陰、陽性血清判斷結(jié)果，羊待測血清在1∶100倍稀釋管出現(xiàn)“++”以上凝集時，可判定為陽性；若在1∶50倍稀釋管出現(xiàn)“++”以上凝集時，則為可疑，對可疑血清將在3～4周后重新測試，假如結(jié)果仍為可疑，則可以判定為陽性。

2 結(jié)果

布魯菌病的血清學(xué)試驗結(jié)果如表1所示。在100只山羊血清中，通過RBPT法篩選出37份陽性血清，陽性率為37%。通過SAT方法進一步檢測經(jīng)RBPT試驗已經(jīng)確定為陽性的血清樣品，結(jié)果顯示37個RBPT陽性血清中有20個經(jīng)SAT檢測為陽性，最后確定陽性率為20%。

表1 布魯菌病的血清學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

3.1 發(fā)病原因分析

結(jié)合虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗，研究了萍鄉(xiāng)市某山羊場布魯菌病的發(fā)病率，其布魯菌病陽性率為20%?？梢娫撗驁鲈谠摬》揽刂羞€是比較松懈，因此會出現(xiàn)母羊經(jīng)常流產(chǎn)的現(xiàn)象。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該羊場布魯菌病陽性率高的原因主要在于以下幾點：一方面，伴隨我國交通基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)的不斷完善，交通運輸業(yè)的發(fā)展為我國養(yǎng)殖業(yè)特別是牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來便利的同時，也增加了跨地區(qū)調(diào)運輸入布魯菌病陽性牛、羊的概率［5］，羊場管理人員疏忽大意，對布魯菌病的危害也不夠重視，沒有對引入的山羊進行檢疫，導(dǎo)致布魯菌病陽性羊被調(diào)入；另一方面，該羊場飼養(yǎng)員沒有注意控制環(huán)境衛(wèi)生，病羊的排泄物以及流產(chǎn)山羊排出的胎衣、胚胎或胎兒未被及時清理，未及時對羊舍進行消毒，加快了該病的傳播。

3.2 防治措施

為了降低布魯菌病的感染率，達到徹底凈化疾病的目的，應(yīng)對羊場的山羊養(yǎng)殖檔案進行系統(tǒng)規(guī)劃與管理，做好山羊耳標號的登記工作，制定布魯菌病檢疫工作計劃，將山羊布魯菌病的檢測納入日常疾病監(jiān)測工作中。對于該病的檢測，最初采用虎紅平板凝集試驗篩選，然后通過試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗或ELISA抗體檢測中的任意一種方法確定［6-8］。對于發(fā)生流產(chǎn)的山羊，在實驗室條件許可的情況下，也可采集流產(chǎn)胎兒或胎衣等流產(chǎn)物進行細菌分離培養(yǎng)或PCR檢測進行診斷［9］。首次進行全群檢疫，需設(shè)置有效的隔離場所和無害化處理場所，及時隔離陽性山羊；間隔2個月再次對陰性山羊全群進行檢疫，連續(xù)檢測2次都為陰性的山羊群定為陰性群（清潔群）。若陰性群山羊發(fā)生流產(chǎn)，應(yīng)及時送檢病料和血樣，檢測結(jié)果為陽性則立即隔離。若從外地引種，最好是從陰性群進行引種。若引種前未檢測該病，在到達目的地后必須隔離飼養(yǎng)2個月以上，期間進行2次布魯菌病的檢測，結(jié)果為陰性的山羊再并入本場陰性群飼養(yǎng)。清潔群建立后，每年至少要對該病進行1次以上的檢疫。

關(guān)于該病的免疫要根據(jù)該病流行情況和 《常見動物疫病免疫推薦方案（試行）》的國家政策綜合選擇。如果在一類地區(qū)（北京、天津、河北、內(nèi)蒙古等15個牛、羊養(yǎng)殖較多的省份和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團），以縣為單位，連續(xù)3年對牛、羊?qū)嵭腥婷庖撸贿B續(xù)免疫3年后，以縣為單位，由省級獸醫(yī)主管部門組織評估考核達到控制標準的，可停止免疫。奶畜個體病原陽性率超過2%的縣，由縣級獸醫(yī)主管部門提出申請，報省級獸醫(yī)主管部門批準后實施免疫。首先進行免疫前檢測，然后淘汰病原陽性牲畜，最后對剩下的病原陰性牲畜接種布魯菌活疫苗（M5株或M5-90株）進行免疫。如果在二類地區(qū)（江蘇、上海、浙江、江西等15個省份），原則上不實施免疫。但未達到控制標準的縣，需要免疫的由縣級獸醫(yī)主管部門提出申請，才能在經(jīng)省級獸醫(yī)主管部門批準后實施免疫，報農(nóng)業(yè)農(nóng)村部備案。如果在凈化區(qū)（海南?。辉试S對牲畜進行免疫。在免疫接種疫苗的過程中，要加強對羊場的管理，定期清理圍欄，及時清理羊的分泌物、糞便和尿液等。

清潔的環(huán)境有利于減少病菌生長，為羊群的生長提供一個較為舒適的環(huán)境。定期進行羊舍及設(shè)施的消毒工作，從而抑制或減少病菌滋生繁殖，有效防止疾病的發(fā)生；對于流產(chǎn)母畜的排泄物和流產(chǎn)物，要及時清理和無害化處理，每天加強消毒1次；最后通過營養(yǎng)調(diào)控和日常保健工作提高山羊自身的免疫力，從而提高羊群的整體抵抗力，降低疾病發(fā)生率［10］。

布魯菌病是一種人畜共患疾病，布魯菌存在于流產(chǎn)母羊的糞便、乳汁、內(nèi)臟和皮毛以及被病原菌污染的水、物品和飼料中，是羊群之間以及人布魯菌病的傳染源；傳播途徑廣泛，可經(jīng)皮膚、黏膜、消化道和交配等途徑進行傳播，對羊群和人類危害都很大［11-12］。建議該羊場一定要從觀念上重視該病，切實采取措施降低該病的發(fā)生率，做好凈化該病的詳細計劃，并采取措施使山羊養(yǎng)殖場最終成為布魯菌病陰性場，這樣既可以增加山羊養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，又可從源頭上降低人類感染布魯菌病的發(fā)生率［13-14］。