戴國禮，張兆萍，程 慧，4，張 波，焦恩寧，李彥龍，秦 墾*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所，寧夏銀川 750001;2.國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川 750001;3.甘肅省農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究院，甘肅武威 733006;4.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224)

【研究意義】自交不親和性是植物預(yù)防近親繁殖和保持遺傳變異的一種重要機制，在被子植物中普遍存在［1］。根據(jù)植物自交不親和的遺傳控制機理，將植物的自交不親和性分為孢子體型SSI(Sporophytic self-compatibility，簡稱 SSI)、和配子體型GSI(Gametophytic self-incompatibility，簡稱 GSI)［2］。其中，以茄科、薔薇科和玄參科為代表的配子體自交不親和性是最常見的類型［3］?！厩叭搜芯窟M展】多年研究發(fā)現(xiàn)，GSI植物的自交不親和性由單一的多態(tài)性S-位點控制，該位點為多基因復(fù)合體，至少包括2個自交不親和反應(yīng)特異性決定因子:花柱S基因與花粉S基因［4］。研究證實，薔薇科、茄科及玄參科等GSI類植物具有共同的花柱S基因產(chǎn)物，為一種糖蛋白，且發(fā)現(xiàn)其具有核糖核酸酶活性，故稱為S 核酸酶(S-RNase)［5－6］。S-RNase 是雌蕊-花粉相互識別的關(guān)鍵物質(zhì)，可分解花粉管RNA，抑制花粉管的伸長，從而導(dǎo)致自交不親和［7］。繼1981年首次從花煙草花柱提取物中分離出與自交不親和相關(guān)的S 糖蛋白，1986 年克隆了 S-cDNA 之后［5－6］，已有大量的S-RNase序列得到了克隆。已明確花柱的SRNase在雌蕊識別和拒絕花粉的過程中起著重要作用［8－9］?！颈狙芯壳腥朦c】寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)在中國分布廣泛，為茄科(Solanacease)枸杞屬(Lycium L.)落葉灌木，屬配子體自交不親和植物。有學(xué)者在田間對寧夏枸杞進行了大量的授粉雜交試驗，結(jié)果表明，在寧夏枸杞種內(nèi)存在自交不親和現(xiàn)象，其繁育系統(tǒng)除麻葉系外都屬于專性異交，大多品種具有自交不親和性，在生產(chǎn)上需配置授粉樹［10－11］。育種家已培育出了一定數(shù)量的栽培品種與新優(yōu)系，但目前對各枸杞品種(系)的自交不親和性及相關(guān)基因還缺乏系統(tǒng)深入的研究，使得雜交親本選配與配置授粉樹時具有很大的盲目性，且費時費工?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以16個國內(nèi)枸杞主栽品種(系)和地方品種為試材，應(yīng)用PCR、回收、克隆、測序技術(shù)，開展枸杞品種(系)S-RNase基因的分子生物學(xué)研究，鑒定參試材料的S-RNase基因型，同時了解寧夏枸杞品種自交不親和S-RNase基因的多態(tài)性。同時，通過田間套袋試驗方法，測定親和指數(shù)進行驗證。最終確定各品種的自交親和性及其所含有的S-RNase基因類型，以期為枸杞栽培合理配置授粉樹和雜交親本選配提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16份枸杞品種(系)種植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院國家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃(38°38'49″N，106°09'10″E)，于 2016 年春季采集各品種(系)的嫩葉置于－80℃保存(表1)。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉與套袋試驗 按照秦 墾等對枸杞屬植物自交親和性的檢測和界定方法［10］，對參試材料花蕾進行以下2種處理:①同株同花人工授粉后套袋，檢測單花自交是否親和;②同株異花人工授粉后套袋，檢測株內(nèi)自交是否親和［12］。同一品種(系)每個處理選30個花蕾進行試驗，每個實驗進行3次重復(fù)，35 d后收獲果實，統(tǒng)計每個果實種子含量，進而計算自交親和指數(shù)。以自交親和指數(shù)高低判斷自交親和性強弱，親和類型的劃分主要參照方智遠(yuǎn)、劉后利等的方法進行，自交親和指數(shù)小于5的為自交不親和，自交親和指數(shù)大于5的為自交親和。計算見公式(1)。

自交親和指數(shù)=自交結(jié)實種子總數(shù)/套袋自交花蕾數(shù) (1)

1.2.2 DNA提取及S-RNase基因PCR擴增 采用CTAB法提取各品種(系)基因組DNA。根據(jù)茄科S基因一級結(jié)構(gòu)保守區(qū)序列合成PCR擴增兼并引物。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列信息為:正向 si200:5’-TCYGTWATGMTKAATAACTGC-3’;反向 si552:5’-AAYRCACTTKAGRCTWGGAAC C-3’(圖1)。

摸索擴增條件，建立特異性PCR擴增體系。PCR體系為:依次加入200 ng模板DNA，5 μl 10×Taq Buffer，2.5 nmol dNTPs，正反向引物分別 0.008 nmol，1 U TaqDNA 聚合酶，補充滅菌水至 25 μl，輕彈混勻后加入礦物油，短暫離心。擴增程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，再72℃延伸10 min;4℃保存。

表1 材料名稱及來源Table 1 A list of material name and source

圖1 茄科S基因一級結(jié)構(gòu)Fig.1 The basic structure of Solanaceae S-gene

1.2.3 S-RNase基因擴增產(chǎn)物回收、克隆及測序PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶的有無。按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，每個材料挑15～20個陽性單克隆送去測序，確保每個S基因型至少重復(fù)測定2次。序列委托上海英濰捷基公司測定。

1.2.4 序列分析與比對 借助EditSeq軟件對測序結(jié)果進行預(yù)處理，在NCBI中利用Blastn檢索Gen-Bank中已登陸的S-RNase基因同源序列。用DNAMAN進行多序列比對分析，并推導(dǎo)對應(yīng)的氨基酸，確定測序結(jié)果的S等位基因名稱。

2 結(jié)果與分析

2.1 S-RNase基因特異性擴增

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測各供試材料的PCR產(chǎn)物。由圖2可知，各供試材料均在約500 bp處有一條明顯的亮帶。

2.2 枸杞品種(系)S-RNase基因型鑒定

圖2 枸杞品種的S基因特異性擴增Fig.2 The specific amplification of S-RNase fragments from Lycium barbarum L.cultivars

分析測序結(jié)果，最終獲得除去兩端載體及引物后長為420 bp的目的片段，分別在NCBI中進行Blast，結(jié)合同源比對與序列分析結(jié)果，確定均為枸杞屬的S基因(圖3)。DNA多序列比對結(jié)果顯示:這17個未知S-RNase基因型的參試材料共涉及9種SRNase基因片段，分別標(biāo)記為 A、B、C、D、E、F、G、H和I。同時發(fā)現(xiàn)，這9種S-RNase基因片段在2個高變區(qū)內(nèi)均具有很高的序列多態(tài)性。除‘寧農(nóng)杞1號’外，其余供試材料均含有其中的2種。依據(jù)植物內(nèi)含子(5GT-3AG)的序列特點，同時參考已登陸的茄科S-RNase基因一級結(jié)構(gòu)特點，確認(rèn)了位于高變區(qū)HVa內(nèi)一段長為109 bp的內(nèi)含子序列，進而推導(dǎo)出高變區(qū)及其周圍核苷酸對應(yīng)的氨基酸序列(圖4)。

將這9條序列分別進行Blastn發(fā)現(xiàn)，除G和I兩種序列外，其余7種核苷酸序列與GenBank中已登錄的枸杞S-RNase等位基因部分編碼區(qū)序列相似性均在99%以上，分別為:A序列與S-BARB2(GI:323320147)、B序列與S-BARB8(GI:323320159);C序列與S-BARB3(GI:323320149);D序列與SBARB6(GI:323320155);E序列與S-CHIN3(GI:323320165);F序列與S-BARB9(GI:323320161);H序列與S-CHIN6(GI:323320169)。由以上7種類型的S-RNase基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸和對應(yīng)同源性最高的已登錄S-RNase等位基因推導(dǎo)的氨基酸序列也完全一致，依據(jù)S-RNase基因相同時其DNA序列同源性應(yīng)為100%的原理，認(rèn)定為同一種基因。

2.3 2個新S-RNase基因型的序列分析

同源性分析結(jié)果顯示，G序列與已登錄S等位基因 S-BARB6(GI:323320155)一致性最高，達(dá)98%，推導(dǎo)的氨基酸序列一致性達(dá)95%。分析其氨基酸序列特征，在高變區(qū)HVa有2個氨基酸發(fā)生變化:由T→A的突變，導(dǎo)致 M(Methionine)→K(Lysine)的變化;由C→G的突變，導(dǎo)致P(Proline)→A(Alanine)的變化。在高變區(qū)HVb有1個氨基酸發(fā)生變化:由G→C的突變，導(dǎo)致K(Lysine)→N(Asparagine)的變化。在保守區(qū)C3、C4之間有2個氨基酸發(fā)生變化。分析比較已登錄的枸杞屬S等位基因，發(fā)現(xiàn)S基因的多態(tài)性主要是因為高變區(qū)(H V)的變異，通常根據(jù)高變區(qū)的不同來確認(rèn)不同的S等位基因，由此認(rèn)定G序列為一個新的S-RNase等位基因，暫將其命名為S-BARB6n。

圖3 S-RNase基因序列同源性比較Fig.3 Alignment of nucleotide sequences of S-RNase

圖4 9種片段推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 Putative amino acid sequences of nine fragments

圖5 G序列與S-BARB6等位基因DNA序列比對Fig.5 The result of DNA sequences alignment between G and S-BARB6 allele

圖6 G序列與S-BARB6等位基因的氨基酸序列比對Fig.6 The result of amino acid sequences alignment between G and S-BARB6 allele

圖7 I序列與S-PUMI5u等位基因DNA序列比對Fig.7 The result of DNA sequences alignment between I and S-PUMI5u allele

圖8 I序列與S-PUMI5u等位基因的氨基酸序列比對Fig.8 The result of amino acid sequences alignment between I and S-PUMI5u allele

I序列與已登錄S等位基因S-PUMI5u(GI:323320217)一致性最高，達(dá)96%，推導(dǎo)的氨基酸序列一致性達(dá)89%，分析比較氨基酸序列特征，在高變區(qū)HVa有6個氨基酸發(fā)生變化:由G→T的突變，導(dǎo)致D(Aspartic acid)→Y(Tyrosine)的變化;由G→C的突變，導(dǎo)致R(Arginine)→P(Proline)的變化;由C→G的突變，導(dǎo)致F(Phenylalanine)→L(Leucine)的變化;由G→A的突變，導(dǎo)致D(Aspartic acid)→N(Asparagine)的變化;由C→A的突變，導(dǎo)致T(Threonine)→K(Lysine)的變化;由C→G的突變，導(dǎo)致L(Leucine)→V(Valine)的變化。在高變區(qū)HVb有3個氨基酸發(fā)生變化:由GAG→CGA的突變，導(dǎo)致K(Lysine)→N(Asparagine)的變化;由C→A的突變，導(dǎo)致S(Serine)→D(Aspartic acid);由C→A的突變，導(dǎo)致A(Alanine)→D(Aspartic acid)。在保守區(qū)C3、C4之間有2個氨基酸發(fā)生變化。認(rèn)定I序列也是一個新的S-RNase等位基因，暫命名為S-PUMI5un。

2.4 參試材料自交(不)親和性的田間驗證

通過田間授粉實驗，可以發(fā)現(xiàn)參試的16個品種(系)，有11個屬于自交不親和材料，和同株自花交和同株異花交自交親和指數(shù)小于5的為自交不親和;5個屬于自交親和材料，其同株自花交自交和同株異花交自交親和指數(shù)大于5的為自交親。

其中自交親和品種(系)的基因型為:‘寧杞1號’、‘寧 農(nóng)杞 3 號’、‘03-08’、(S-BARB2/SBARB8)，‘寧杞7號’(S-BARB8/S-BARB6)、‘山東黃果枸杞’(S-BARB2/S-PUMI5un);其中自交不親和品種(系)的基因型為:‘中國枸杞’(S-BARB2/SCHIN6)，‘云南枸杞’(S-BARB3/S-CHIN3)，‘黃果枸杞’(S-BARB3/S-BARB6n)，‘寧杞 5號’(SBARB2/S-CHIN3)，‘寧農(nóng)杞 1號’(S-BARB2/SBARB2)，‘寧農(nóng)杞 2號’(S-BARB2/S-BARB6n)，‘寧農(nóng)杞9號’(S-BARB2/S-BARB9)，‘07-05’(SBARB8/S-BARB6n)，‘06-16’(S-BARB2/S-CHIN3)，‘07-08’(S-BARB8/S-BARB6n)，‘13-01’(S-BARB 2/S-CHIN3)。

3 討論

3.1 枸杞SI與SC之間S-RNase基因型比較

本研究對11個自交不親和5個自交親和品種(系)的 S-RNase基因型進行比較分析發(fā)現(xiàn):SBARB2、S-BARB8等位基因具有很高的基因頻率，氨基酸多序列比對結(jié)果顯示，S-BARB8等位基因在C4保守區(qū)后的外顯子位置與其他幾種等位基因相比有2個位點的氨基酸同時發(fā)生變化，即Q/D→L和D/G→H，由此引起的S-RNase基因表達(dá)產(chǎn)物的變化，有可能是枸杞自交不親和向自交親和突變發(fā)生的根本原因。枸杞自交不親和S-RNase基因的系統(tǒng)進化演變，還需進一步研究。

3.2 枸杞S-RNase的氨基酸序列的特異性

枸杞屬(Lycium L.)從經(jīng)典分類學(xué)上屬于為茄科(solanacease)，茄科中S-RNase有5個保守區(qū)域(C1 到 C5)和 2 個高變異區(qū)(Hva 和 HVb)［16－17］。并且在茄科的S-RNase中存在的潛在N-糖基化保守位點在C2區(qū)，對比其他配子體自交不親和植物，如薔薇科的S-RNase的C2區(qū)卻沒有包含N-糖基化位點，同時Ushijima［18］等的研究中，提出薔薇科的 SRNase不僅有 C1、C2、C3、C4，4 個保守區(qū)，而且還有一個RC4區(qū)，RC4是薔薇科所特有的專一性區(qū)域，在其他T2/S型的S-RNase中沒有發(fā)現(xiàn)。并且指出高度變異區(qū)RHV定位在與茄科S-RNase的高變異區(qū)相似的位置，茄科S-RNase的另一個變異區(qū)HVb在薔薇科的S-RNase中卻是保守的［14］。本研究所克隆的枸杞S-RNase基因片段，大小為420 bp，包含了C2、C3、C4保守區(qū)，和 2個高變異區(qū)(Hva和HVb)，并對不同品種(系)的S-RNase基因型進行了鑒定，但是沒有得到全長序列，對其結(jié)構(gòu)和特異識別位點的分析存在難度，這也是本研究的不足之處。

表2 16個枸杞品種(系)的自交親和性及其S-RNase基因型Table 2 The self-compatibility and S-RNase genotypes of seventeen Lycium L.cultivars

3.3 枸杞S-RNase基因型鑒定的意義

已證實，品種間的親和性和S-RNase基因型間存在密切聯(lián)系，若2個品種的S-RNase基因型相同，則相互授粉不親和，否則表現(xiàn)為親和。對于鑒定出的11份自交不親和枸杞品種(系)，生產(chǎn)中在配置授粉品種或雜交育種在選配親本時，品種間的親和性是首要考慮因素，而本研究S-RNase基因型鑒定結(jié)果即可提供有利依據(jù)。

本研究結(jié)果不僅豐富了枸杞屬植物的自交不親和基因信息，同時能為生產(chǎn)中授粉樹的配置，雜交育種親本選配提供理論依據(jù)。繼續(xù)深入研究枸杞花柱、花粉S-RNase基因及表達(dá)產(chǎn)物功能與相互作用機制是未來枸杞自交不親和性研究領(lǐng)域重要的發(fā)展方向。

4 結(jié)論

本研究以16個品種(系)為材料，共克隆9個S等位基因，分別為 S-BARB2、S-BARB3、S-BARB6、SBARB8、S-BARB9、S-CHIN3、S-CHIN6，并發(fā)現(xiàn) 2 個新的S等位基因，暫分別命名為 S-BARB6n，S-PUMI5un。所克隆獲得的9個枸杞S-RNase基因均包含了C2、C3、C4保守區(qū)，和2個高變異區(qū)(Hva和HVb)。通過田間驗證試驗證明，11個品種(系)為自交不親和材料，5個為自交親和材料。枸杞屬植物存在S-RNase等位基因，其基因序列與茄科植物具有一定相似性，枸杞S-RNase基因是控制枸杞自交不親和性的關(guān)鍵基因，可根據(jù)本實驗結(jié)果進行授粉樹的配置和雜交育種親本選配。