顧曉穎，王文思，陳 家，趙丹丹，李凌飛*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南昆明 650205)

【研究意義】花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA或 AA)，即全順-5，8，11，14-二十碳四烯酸，屬于 ω-6系列PUFAs，是人體三大必需脂肪酸之一，具有卓越的藥用價值和營養(yǎng)保健功能，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域［1］。傳統(tǒng)來源的ARA非常有限，還需面對資源枯竭、環(huán)境污染和提取成本高等現(xiàn)實(shí)問題［2］，已無法滿足日益增長的市場需求。微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA可以克服傳統(tǒng)來源的缺點(diǎn)，是制備ARA的新途徑［3］。高山被孢霉(Mortierlla alpina)是發(fā)酵生產(chǎn)ARA的商業(yè)菌株，其菌絲中含有大量PUFAs，以ARA為主，占 PUFAs總量的68.5% ～78.8%［4］。此外，安全性評估認(rèn)定 M.alpina及其發(fā)酵產(chǎn)品是安全可食用的［5］。優(yōu)化發(fā)酵條件是提高M(jìn).alpina ARA產(chǎn)量最簡單有效的方法，但菌株間的差異導(dǎo)致最佳發(fā)酵條件普適性差。因此，優(yōu)化發(fā)酵條件仍是目前M.alpina的研究熱點(diǎn)，亦是M.alpina高產(chǎn)ARA的瓶頸?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】M.alpina生長可用碳源有葡萄糖、木糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油等，可用有機(jī)氮源有尿素、豆粕粉、酵母浸粉等，可用無機(jī)氮源有硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨等。一些研究對M.alpina的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，菌體生物量和ARA產(chǎn)量都有不同程度的提高［6－8］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】生物量的積累是以養(yǎng)分的吸收為基礎(chǔ)的，其能反映養(yǎng)分的吸收狀況［9］。ARA屬于M.alpina的胞內(nèi)代謝物，生物量和ARA產(chǎn)量密切相關(guān)，項(xiàng)目前期研究結(jié)果，M.alpina菌絲中ARA含量與菌體生物量呈顯著正相關(guān)(r=0.609，n=180，P ＜0.001)。本試驗(yàn)以前期篩選出的3株ARA高產(chǎn)菌株為對象，以菌體生物量為主要考核指標(biāo)，對M.alpina的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期獲得較高的菌體生物量和ARA產(chǎn)量，為利用M.alpina工業(yè)化生產(chǎn)ARA奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

高山被孢霉(M.alpina):項(xiàng)目前期篩選出的3株高產(chǎn)ARA的菌株(D1、N24和11f01)。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L，酵母提取物 6 g/L，KH2PO43 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 自然;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L，酵母提取物11 g/L，KH2PO43.8 g/L，NaNO33.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 自然。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)過121℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化 將常溫石蠟油封存的菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)7 d。

1.3.2 種子培養(yǎng) 挑取少量活化后的菌絲于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min，25℃搖瓶培養(yǎng)3 d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 從種子培養(yǎng)液中挑取10～15個直徑為1～2 mm的菌球，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，25℃，150 r/min培養(yǎng)7 d，每個樣做3個重復(fù)。

1.3.4 碳源種類優(yōu)化 控制基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件不變，分別以葡萄糖80 g/L、乳糖80 g/L、蔗糖80 g/L為碳源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 氮源種類優(yōu)化 在確定最佳碳源基礎(chǔ)上，分別以酵母浸粉、NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、NH4Cl(按相同總氮量計(jì)算)為氮源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 根據(jù)優(yōu)化出的最佳碳氮源種類，按表1設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。

1.3.7 生長溫度優(yōu)化 最佳培養(yǎng)基配方確定后，分別于15、20、25、30 ℃條件下發(fā)酵 M.alpina以確定最佳生長溫度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌體生物量的測定 將發(fā)酵獲得的菌絲體真空抽濾后，用去離子水洗滌菌體3次，菌體置－20℃預(yù)凍過夜后真空冷凍干燥3 d，測得菌體生物量(干重)。

1.4.2 ARA含量分析 準(zhǔn)確稱取50 mg干菌體粉末于具蓋試管中，加入1 mL甲苯，2 mL 1%的硫酸甲醇，1 mL C17∶0正己烷標(biāo)樣(濃度為 1 mg/mL;十七烷酸標(biāo)品純度為99%，購自Sigma公司)，混勻后置于50℃水浴過夜。冷卻后加入5%NaCl水溶液，混勻后加入正己烷萃取2次，合并上清液(正己烷)。再加入2%KHCO3水溶液清洗，收集上清液氮?dú)獯蹈?。獲得的脂質(zhì)復(fù)溶于1 mL含0.05%BHT的正己烷溶液中，過濾后待測。

采用氣相色譜-質(zhì)譜連用儀(GC-MS)進(jìn)行脂肪酸的定性和定量分析(安捷倫5975C-7890A)。設(shè)置參數(shù):色譜柱Hp-5Max(30 m×0.25 mm)，載氣為氦氣，流速1 mL/min;色譜條件:進(jìn)樣口溫度為250℃，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積 1 μl，分流比 50∶1，柱起始溫度80℃，保持3 min，然后以20℃/min升至180℃，保持1 min，再以1℃/min升至210℃保持5 min，最后以5℃/min升至240℃保持8 min。按照標(biāo)準(zhǔn)譜庫對菌體中脂肪酸進(jìn)行定性分析，以C17∶0為參照內(nèi)標(biāo)，根據(jù)峰面積對ARA進(jìn)行定量分析。

表1 L9(34)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design

表2 高山被孢霉菌絲中脂肪酸含量Table 2 Fatty acid contents in mycelia of M.alpina

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對同一菌株不同碳源/氮源之間，以及同種碳源/氮源不同菌株之間的菌體生物量進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)一步采用SNK法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株高產(chǎn)ARA的高山被孢霉菌株脂肪酸含量分析

如表2所示，3株M.alpina菌絲中均含大量脂肪酸，總脂肪酸含量可達(dá)菌絲干重的45%，且所含脂肪酸種類豐富，組成合理。菌絲中脂肪酸包括飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。單不飽和脂肪酸主要為 C16∶0和 C18∶0，是合成各個不飽和脂肪酸的前體;單不飽和脂肪酸作為PUFAs合成過程的中間體，主要以 C18∶1為主;PUFAs(C18∶2，C18∶3，C20∶3和 C20∶4) 是菌絲中的主要脂肪酸種類，其含量可高達(dá)總脂肪酸含量的50%，而 ARA(即C20∶4)作為主要的 PUFAs，在 D1、N24 和 llf01 菌絲中分別為 141.39、152.01 和 111.71 mg/g，在 PUFAs中所占比例可達(dá)64%。

圖1 不同碳源對高山被孢霉菌體生物量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the biomass of M.alpina

表3 不同碳源發(fā)酵時高山被孢霉菌體生物量的單因素方差分析Table 3 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different carbon sources

2.2 3種碳源對3株高山被孢霉菌體生物量的影響

3株菌的最佳碳源均為葡萄糖(圖1)，同一菌株3種碳源發(fā)酵時菌體生物量統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明，3種碳源對每株菌的生物量均有顯著影響(表3)。D1菌株以葡萄糖為碳源時，所獲生物量顯著高于蔗糖，且蔗糖顯著大于乳糖;N24菌株與11f01菌株一樣，以葡萄糖為碳源，所獲生物量顯著大于蔗糖和乳糖，但蔗糖和乳糖間無顯著差異(圖1)。同一種碳源3個菌株之間生物量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，每一種碳源對3株菌的生物量也都具有顯著影響(表3)。以葡萄糖為碳源，D1和N24菌株的生物量顯著高于11f01;以蔗糖為碳源，N24和llf01生物量顯著高于D1菌株;而以乳糖為碳源，N24生物量顯著高于llf01，且llf01顯著高于D1(圖1)。

圖2 不同氮源對M.alpina生物量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the biomass of M.alpina

表4 不同氮源發(fā)酵時M.alpina生物量的單因素方差分析Table 4 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different nitrogen sources

2.3 6種氮源對3株高山被孢霉菌體生物量的影響

3株菌的最佳氮源均為酵母浸粉(圖2)，同一菌株6種氮源發(fā)酵時菌體生物量統(tǒng)計(jì)分析表明:6種氮源對每株菌的生物量均有顯著影響(表4)，D1菌株以酵母浸粉為氮源時，其生物量顯著高于硝酸銨，硝酸銨顯著高于硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨，以硝酸鈉為氮源時生物量最低;N24菌株以酵母浸粉為氮源時其生物量顯著高于硝酸銨，硝酸銨顯著高于硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨(后3種氮源所獲生物量無顯著差異)，以氯化銨為氮源時生物量最低;11f01菌株以酵母浸粉為氮源所獲生物量最高，其次為硝酸銨，硝酸鉀和氯化銨無顯著差異，以硝酸鈉為氮源時生物量最低(圖2)。同一種氮源3個菌株之間生物量的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，每一種氮源對3株菌的生物量均有顯著影響(表4)，以酵母浸粉為氮源，N24菌株生物量顯著大于D1，且D1顯著大于llf01;以硝酸鈉和硫酸銨為氮源，3株菌生物量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;以硝酸鉀和氯化銨為氮源，llf01菌株生物量顯著大于D1和N24;以硝酸銨為氮源，D1菌株生物量顯著大于N24，且N24顯著大于llf01(圖2)。

2.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳、氮源對M.alpina菌體生長有較大影響。據(jù)報道，KH2PO4濃度及發(fā)酵液初始pH值對菌株生長也有較大影響，因此本試驗(yàn)在上述最佳碳源葡萄糖、最佳氮源酵母浸粉的基礎(chǔ)上，再選取初始pH值及KH2PO4進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

2.4.1 D1菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化 表5為D1菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)分析顯示:4個因素對D1菌株生物量影響大小依次為酵母浸粉＞KH2PO4＞初始 pH值 ＞葡萄糖。最佳組合為A2B1C2D3，即D1菌株的最佳培養(yǎng)基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉15 g/L;初始pH 5.5。其中葡萄糖濃度為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.5倍，KH2PO4濃度由原先的3.8下降至1。

2.4.2 N24菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化 表6為N24菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)分析顯示:4個因素對N24菌株生物量影響大小依次為初始pH值＞酵母浸粉＞KH2PO4＞葡萄糖。最佳組合為A2B1C3D2，即N24菌株的最佳培養(yǎng)基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉20 g/L;初始pH6.0。于最優(yōu)配方條件下發(fā)酵M.alpina進(jìn)行驗(yàn)證，所獲菌體生物量為26.70 g/L，相比表6中最高值(25.96 g/L)提高了 2.9%。

表5 D1菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)Table 5 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of D1 strain

表6 N24菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)Table 6 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of N24 strain

2.4.3 11f01菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化 表7為11f01菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果。數(shù)據(jù)分析顯示:4個因素對11f01菌株生物量影響大小依次為KH2PO4＞酵母浸粉＞初始pH值＞葡萄糖。最佳組合為A2B1C2D2，即11f01菌株的最佳培養(yǎng)基配方:葡萄糖120 g/L;KH2PO41 g/L;酵母浸粉15 g/L;初始pH 6.0。于最優(yōu)配方條件下發(fā)酵M.alpina進(jìn)行驗(yàn)證，所獲菌體生物量為22.20 g/L，相比表7中最高值(21.30 g/L)提高了4.2%。

2.5 發(fā)酵溫度優(yōu)化

基于上述最優(yōu)培養(yǎng)基配方，于不同溫度下發(fā)酵M.alpina。結(jié)果表明發(fā)酵溫度對菌株生物量影響顯著。各菌株的生物量均隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，不同溫度所獲生物量大小順序?yàn)?0℃ ＞25℃ ＞15℃ ＞30℃(圖3)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，同一溫度下，3株菌的生物量均有顯著差異(P值均小于0.001，表8)。同一溫度下不同菌株的生物量方差分析結(jié)果表明，當(dāng)溫度為15、20和25℃，D1、N24菌株生物量均顯著大于llf01;而溫度為30℃時，3株菌的生物量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3，表8)。

表7 11f01菌株培養(yǎng)基優(yōu)化L9(34)正交實(shí)驗(yàn)Table 7 The orthogonal experiment L9(34)for optimization of culture medium of 11f01 strain

圖3 不同溫度對M.alpina菌體生物量的影響Fig.3 Effect of different temperature on the biomass of M.alpina

2.6 最優(yōu)發(fā)酵條件驗(yàn)證

于最優(yōu)條件下發(fā)酵M.alpina，3株菌的生物量均與模型理論值接近。D1菌株生物量由21.86 g/L增加至26.67 g/L，增加了22.0%;N24菌株生物量由 23.46 g/L 增加至 27.07 g/L，增加了 15.39%;11f01菌株生物量由18.75 g/L增加至23.20 g/L，增加了23.73%。

GC-MS測定脂肪酸含量，3株菌菌絲中ARA產(chǎn)量變化如下:D1菌株ARA產(chǎn)量由3.09 g/L增至4.29 g/L，增長率為38.79%;N24菌株ARA產(chǎn)量由3.57 g/L 增至 4.39 g/L，增長率為 23.16%;11f01菌株ARA產(chǎn)量由 2.09 g/L增至3.45 g/L，增長率為 64.59%。

3 討論

3.1 碳源對高山被孢霉菌體生物量的影響

霉菌可利用的碳源很多，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉糖化液、糖蜜、果糖等。本研究結(jié)果表明M.alpina生長的最適碳源為葡萄糖，此結(jié)果與Nisha［10］和 Chatzifragkou［11］的研究結(jié)果一致。M.alpina 能較好地利用葡萄糖而非其他碳源進(jìn)行菌絲增殖生長，其原因可能是葡萄糖相比其他碳源更易被直接利用，這增加了菌株對葡萄糖的同化效率以至獲得更高的菌體生物量。

3株菌發(fā)酵生產(chǎn)的最適葡萄糖濃度均為120 g/L。當(dāng)葡萄糖濃度過高時(160 g/L)，培養(yǎng)液滲透壓增大，粘度升高，不利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞;當(dāng)葡萄糖濃度過低時(80 g/L)，細(xì)胞生長可能受到抑制過早進(jìn)入衰退期。

3.2 氮源對高山被孢霉菌體生物量的影響

氮源分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源，不同種類和不同濃度的氮源都能影響代謝產(chǎn)物合成的方向和產(chǎn)量［8］。Lu［12］等在不同氮源條件下發(fā)酵 M.alpina，發(fā)現(xiàn)以酵母提取物為氮源時，獲得最高生物量和總脂肪酸產(chǎn)量，以硝酸鈉為氮源有利于ARA積累，但所獲生物量較低。M.alpina可利用的氮源有硝酸鹽、銨鹽、豆粕粉、氨基酸、酵母浸粉、尿素等。本研究結(jié)果表明酵母浸粉是發(fā)酵M.alpina的最適氮源，此結(jié)果與一些研究一致［13－14］，其原因可能是酵母浸粉作為較復(fù)雜的有機(jī)氮源，其不僅為M.alpina的生長提供氮元素，還可能提供維生素、無機(jī)鹽等微量元素。

表8 不同溫度發(fā)酵時高山被孢霉菌體生物量的單因素方差分析Table 8 One-way ANOVA of the biomass of M.alpina with different temperature

3.3 KH2PO4對高山被孢霉菌體生物量的影響

礦物鹽主要影響細(xì)胞壁的電荷，會造成菌絲形態(tài)的改變［15］，而菌絲形態(tài)與菌株生長狀況密切相關(guān)。Higashiyama［16］等研究了礦物鹽對ARA產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中含有Na2SO4、CaCl2、MgCl2而無KH2PO4時，主要菌體形態(tài)成2～3 mm的大球型，顆粒壁的傳質(zhì)限制導(dǎo)致菌球中心菌絲的自溶，生物量降低。這可能是因?yàn)榫昴芾肒H2PO4中的磷合成結(jié)構(gòu)組織和大量聚合磷酸鹽。本研究選擇了3個 KH2PO4濃度(1、3、5 g/L)對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明3株菌均是KH2PO41 g/L為最佳濃度。范益春［17］等發(fā)現(xiàn)在磷限制條件下發(fā)酵 M.alpina，發(fā)酵周期縮短、生物量和總脂肪酸含量增加，這進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果。

3.4 初始pH對高山被孢霉菌體生物量的影響

發(fā)酵pH對M.alpina的生長具有較大影響。鄭志達(dá)［18］等研究發(fā)現(xiàn)在pH 6.0時所獲菌體生物量最大，其次為pH 5.5，pH對油脂中ARA比例無影響，弱酸性有利于菌株生長和油脂積累。鄧中濤［19］等研究發(fā)現(xiàn)在pH 5.5～6.5時所獲菌株生物量和油脂含量差異不顯著，當(dāng)pH 7.5時會抑制菌株對葡萄糖的吸收，菌體生物量和油脂含量最低，弱酸性有利于菌株生長和油脂積累。Li［20］等的研究認(rèn)為pH為5.5時有利于菌株生長，而pH 6.5時有利于油脂的積累。本研究的結(jié)果表明，pH 5.5或pH 6.0是菌株生長的最適pH，不同菌株間的最佳pH值存在細(xì)微差別。

3.5 溫度對高山被孢霉菌體生物量的影響

一些研究表明低溫能促進(jìn)產(chǎn)油微生物積累更多的PUFA，但會抑制微生物的生長。本研究結(jié)果20℃是M.alpina生長的最適發(fā)酵溫度。當(dāng)發(fā)酵溫度低于20℃時，菌絲生長受到抑制。其原因可能是較低溫度不利于菌株吸收利用葡萄糖，導(dǎo)致整個發(fā)酵過程中菌株生長緩慢;此外，菌株在低溫條件下存在更長的延滯期，這也是生物量降低的因素之一［21］。M.alpina生長是一個高需氧的過程，發(fā)酵液溶氧能力會隨著溫度的升高緩慢降低，當(dāng)溫度達(dá)到25℃或高于25℃時，發(fā)酵液中低的溶氧量會抑制菌株生長，導(dǎo)致菌體生物量降低。

3.6 優(yōu)化后獲得的M.alpina生物量與ARA產(chǎn)量

在本研究中，優(yōu)化后3株M.alpina菌株的生物量分別為 26.67、27.07 和 23.02 g/L，增幅達(dá) 22.0%、15.39% 和 23.73%;ARA 含量分別為 4.29、4.39 和 3.45 g/L，增幅達(dá) 38.79%、23.16% 和64.59%。與有些研究相比，生物量和ARA含量增加幅度不高［6－7］，其原因主要是這 3株菌株是從151株菌中篩選出的高產(chǎn)ARA的菌株，生物量和ARA含量提升的空間有限。沈以凌［8］等對M.alpina發(fā)酵生產(chǎn)ARA的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得較高的菌體生物量和ARA產(chǎn)量，分別為26.95和4.86 g/L，本研究優(yōu)化后 M.alpina的生物量和ARA含量與之相當(dāng)。

4 結(jié)論

通過研究M.alpina的發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)碳源、氮源、KH2PO4、pH值、發(fā)酵溫度均對菌體生物量有重要影響。M.alpina發(fā)酵的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸粉，較低濃度的KH2PO4和弱酸性(pH 5.5～6.0)有利于菌株生長，最適發(fā)酵溫度為20℃。3株菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方僅酵母浸粉和pH值存在細(xì)微差別。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，3株菌的菌體生物量和ARA含量均有明顯提高。