張郃

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巖藻糖環(huán)境對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞Aβ42蛋白內(nèi)化過(guò)程的影響

張郃

100053 北京，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，Email：zhanghe0718@sina.com

探討巖藻糖環(huán)境對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化不同形態(tài) Aβ42蛋白過(guò)程的影響。

分別測(cè)定巖藻糖富集及缺失兩種環(huán)境中小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞及大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)單體及寡聚體 Aβ42蛋白的攝取量，檢測(cè)被巖藻糖活化后小膠質(zhì)細(xì)胞的 MAPK 激酶磷酸化程度變化，探明清道夫家族 SRA 受體及 SRB 受體在兩種膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)差異。

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞在巖藻糖預(yù)處理及巖藻糖環(huán)境持續(xù)作用下對(duì) Aβ42單體攝取量均顯著增加，巖藻糖預(yù)處理導(dǎo)致大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞單體Aβ42攝入量降低。巖藻糖預(yù)處理導(dǎo)致小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)寡聚體 Aβ42攝取量下降，巖藻糖持續(xù)作用后，該趨勢(shì)出現(xiàn)反轉(zhuǎn)。基因檢測(cè)表明兩種膠質(zhì)細(xì)胞中 SRB 受體高表達(dá)，SRA 受體在星型膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)表達(dá)。巖藻糖持續(xù)作用引起小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 p38-MAPK 信號(hào)通路的激活，該信號(hào)可能引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞吞飲過(guò)程。

巖藻糖與膠質(zhì)細(xì)胞清道夫受體的作用模式對(duì)細(xì)胞的 Aβ42的內(nèi)化過(guò)程產(chǎn)生影響，SRA 受體可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬過(guò)程中 p38-MAPK 激酶的激活過(guò)程而增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)病理蛋白的攝取。為尋找阿爾茨海默病中膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的潛在免疫治療靶標(biāo)提供了理論依據(jù)。

小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞； 星型細(xì)胞； 內(nèi)化； 巖藻多糖； 表面吞噬受體； 阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋD）是老年期癡呆最常見(jiàn)的類型，也是老年人致殘致死的第四位病因[1]。其病理特征為腦內(nèi)病理性蛋白 Aβ 大量沉積形成斑塊，圍繞其四周的高激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞喪失了原有的 Aβ 蛋白清除能力，同時(shí)釋放大量炎癥因子導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元損傷及進(jìn)一步的認(rèn)知障礙[2-4]。膠質(zhì)細(xì)胞在 AD 的進(jìn)程中占據(jù)核心地位[5-6]，可通過(guò)其表面清道夫家族受體清除腦內(nèi)不同聚集形態(tài)的 Aβ，上述受體結(jié)構(gòu)上并不同源，但進(jìn)化上高度保守[7]，通過(guò)與病原相關(guān)分子模式（入侵的病原體或病理性蛋白構(gòu)象）相互作用來(lái)激活或抑制膠質(zhì)細(xì)胞活性，從而調(diào)節(jié)腦內(nèi)免疫環(huán)境，如 SRA、SRB 受體。巖藻糖（fucoidan）是一種具有抗腫瘤活性的多聚陰離子結(jié)構(gòu)多糖[8]，其分子結(jié)構(gòu)正是膠質(zhì)細(xì)胞模式識(shí)別受體家族的典型識(shí)別結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是清道夫家族受體的非特異性配體[9]，在對(duì)細(xì)胞表面受體產(chǎn)生占位性阻滯作用的同時(shí)可引發(fā)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)并誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步的生物學(xué)功能，該多糖的存在環(huán)境可能對(duì)不同聚集形式的 Aβ 蛋白進(jìn)入膠質(zhì)細(xì)胞造成影響。Aβ 蛋白進(jìn)入細(xì)胞消化清除的途徑由該蛋白的聚集形態(tài)決定[10]。內(nèi)吞作用被廣義地分為兩類，吞噬作用和胞飲作用，吞噬作用是指內(nèi)吞大于 200 nm 的顆粒物質(zhì)；胞飲是內(nèi)吞的一種形式，與其他內(nèi)吞形式的吞噬直徑相比，巨胞飲體直徑較大，在某些因素刺激下，細(xì)胞膜皺褶形成大且不規(guī)則的原始內(nèi)吞泡，直徑可達(dá) 5 μm。膠質(zhì)細(xì)胞胞膜蛋白肌動(dòng)蛋白重組過(guò)程依賴 p38-MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，因此 p38-MAPK 的激活可能參與膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)單體 Aβ42的胞飲過(guò)程，本研究采用巖藻糖作為研究工具，探討膠質(zhì)細(xì)胞表面模式識(shí)別受體內(nèi)化不同形式 Aβ 蛋白的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

單體Aβ42（mAβ42）和寡聚體 Aβ42（oAβ42）微量蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本IBL 公司；Aβ 蛋白 4G8 抗體購(gòu)自美國(guó) Covance 公司；大鼠抗小鼠 SRA 抗體購(gòu)自英國(guó) AbD Serotec公司；Trizol RNA 提取試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1621 購(gòu)自美國(guó) Fermentas 公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；ABI9700 型和OpticonMonitor2 型PCR 擴(kuò)增儀分別購(gòu)自美國(guó) ABI 公司和Bio-Rad 公司；甘氨酸、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、Tris 鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、TMB 顯色底物購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Amresco 公司；低糖 DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自德國(guó) Calbiochem 公司；蛋白磷酸化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；25 cm 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔板、96 孔板購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；DL2000 marker 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Aβ42蛋白購(gòu)自美國(guó) Peptide 公司；巖藻多糖購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Molecular Devices 公司；BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自通派（上海）生物科技有限公司；大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó) Sciencell 公司；DAPI、山羊血清、FITC 標(biāo)記羊抗鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記羊抗大鼠二抗、ECL 發(fā)光試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；胞膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó) Merck Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 mAβ42和 oAβ42的制備 mAβ42制備：用 HFIP 將 Aβ42溶解至 1 mg/ml，水浴超聲 10 min 后，分裝于離心管，待 HFIP 揮發(fā)過(guò)夜后–20 ℃凍存。使用時(shí)每 30 μg 的 Aβ42用 1 μl 的 DMSO 溶解，水浴超聲 5 min 后按實(shí)驗(yàn)所需濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基。

oAβ42制備：將 Aβ42用 DMSO 溶至5 mmol/L，水浴超聲后用培養(yǎng)基稀釋至 100 μmol/L，在 4 ℃孵育 24 h[11]。

1.2.2 蛋白磷酸化水平測(cè)定 于 96 孔板接種 BV2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，密度 3 × 105個(gè)/孔，加入巖藻糖（100 μg/ml）或 oAβ42（1 μmol/L）后孵育2 h，對(duì)照組不做處理。免疫熒光法測(cè)定 MAPK 激酶家族磷酸化水平，按試劑盒說(shuō)明，每孔加入 50 μl 混有顯色增強(qiáng)劑的裂解液進(jìn)行裂解。各孔裂解物轉(zhuǎn)移至相應(yīng)磷酸化蛋白檢測(cè)孔板。加入相應(yīng)磷酸化蛋白的捕獲抗體與檢測(cè)抗體的等體積混合物，經(jīng)孵育后用 0.05% PBST 洗 3 遍。各孔加入 100 μl 的 ADHP 顯色底物，300 r/min 孵育 10 min 后加入停止液終止反應(yīng)，以 530 ~ 540 nm 為激發(fā)光波長(zhǎng)，于 590 ~ 600 nm 處檢測(cè)各組熒光信號(hào)強(qiáng)度，表示為蛋白磷酸化水平。

1.2.3 膠質(zhì)細(xì)胞攝取 Aβ 蛋白量的測(cè)定 于 6 孔板中完成該細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作，接種密度約 106個(gè)/孔，于BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞（或星型膠質(zhì)細(xì)胞）培養(yǎng)基中加入 mAβ42（1 μg/ml）或 oAβ42（1 μmol/L）約4.5 μg/ml，孵育 3 h，分別檢測(cè)細(xì)胞中mAβ42和 oAβ42的量。巖藻糖試驗(yàn)組加入巖藻糖（100 μg/ml）孵育細(xì)胞 30 min（預(yù)處理）或 3 h（持續(xù)孵育），其中巖藻糖預(yù)處理組在 30 min 時(shí)吸去原有培養(yǎng)基，PBS 洗 3 次后，加入 mAβ42（1 μg/ml）或 oAβ42（1 μmol/L）繼續(xù)孵育細(xì)胞至 3 h。按蛋白微量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)出各組細(xì)胞裂解并高速離心后上清部分 mAβ42及 oAβ42的蛋白濃度，同時(shí)按 BCA 試劑盒操作步驟測(cè)定各組細(xì)胞實(shí)際蛋白濃度，用 mAβ42及 oAβ42的蛋白濃度除以各組蛋白的實(shí)際濃度，得到該實(shí)驗(yàn)組單位細(xì)胞蛋白中具有的 Aβ42濃度。以對(duì)照組（單獨(dú) oAβ42孵育）細(xì)胞測(cè)得的 oAβ42含量為 100% 換算成百分比形式，即代表被 BV2 細(xì)胞吞噬的 oAβ42的量。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞及大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞以每孔 5 × 105的密度接種至 12 孔板過(guò)夜，加入 mAβ42（1 μg/ml）孵育 5 h。于12 孔板接種 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，用單獨(dú) mAβ42；mAβ42+ 巖藻糖（30 min）、mAβ42+ 巖藻糖（3 h）三個(gè)條件作用 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，之后 PBS 洗細(xì)胞兩次，樣品經(jīng) 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，用 5% 山羊血清室溫封閉 2 h。加入抗 Aβ424G8 抗體（1:500）4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗細(xì)胞 5 遍，加入羊抗鼠 FITC 熒光二抗（1:1000）室溫孵育 2 h，PBS 洗 5 遍。加入 DAPI 室溫孵育 2 h 進(jìn)行細(xì)胞核染色，加入封片劑，4 ℃避光保存。對(duì)照組細(xì)胞的一抗用 PBS 代替，其余操作同前，利用激光共聚焦顯微鏡觀察 mAβ42在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分布（激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm），圖像處理采用 ZEN lite（Carl Zeiss）軟件，用 image J2X 軟件進(jìn)行 FITC 熒光的強(qiáng)度對(duì)比。

1.2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞受體表達(dá)量測(cè)定 用 Trizol 試劑按照說(shuō)明書(shū)提取 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞及大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，使用六核苷酸隨機(jī)引物將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min 為反應(yīng)條件。PCR 檢測(cè)兩種細(xì)胞的 SRA 及 SRB 基因表達(dá)。引物如下：小鼠：SRA-F（RT）ACAACATCACCAACGACC TCAG；SRA-R（RT）GTCCAGTAAGCCCTCTGTC TCC；SRB-F（RT）ACCTCCCAGACATGCTTCCCA TAA；SRB-R（RT）CGATCTTGCTGAGTCCGTTCCA；GAPDH-F ACGGCAAGTTCAACGGCACAG；GAPDH-R CGCCAGTAGACTCCACGACAT；大鼠：SRA-F（RT）TCGTCTGTAGGAGCTTGGGATAC；SRA-R（RT）TGAGCAGCGATTTCATAGTTGTG；SRB1-F（RT）CCCATCCTCACTTCCTCAACG；SRB1-R（RT）CTCAATCTTCCCAGTTTGTCCAAT；GAPDH-F CAAGGGCATCCTGGGCTACACT；GAPDH-R CTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC，95 ℃預(yù)熱 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：60 ~ 92 ℃，每 1 ℃讀取數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) BV2 細(xì)胞膜蛋白中的 SRA 受體表達(dá) 提取 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞富集的膜蛋白成分用于 Western blot 蛋白檢測(cè)，按膜蛋白提取試劑盒說(shuō)明用提取試劑 2A（柔和）或 2B（強(qiáng)烈）各 0.1 ml，各自與膜提取液等體積混合為膜蛋白提取工作液備用。將 BV2 細(xì)胞用冰冷 PBS 洗滌后集中于離心管，4 ℃ 1000 ×離心 5 min 后用1 ml 含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液重懸，4 ℃孵育 10 min。4 ℃、1000 ×離心 5 min，上清即為胞漿（可溶）蛋白部分，沉淀部分為胞膜蛋白成分，即加入細(xì)胞膜提取工作液，搖床室溫孵育45 min。于4 ℃、16 000 ×離心 15 min，棄去沉淀，上清部分即為富集的膜蛋白成分。BCA 法測(cè)定膜蛋白成分的蛋白濃度后，置于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將提取的細(xì)胞膜蛋白與 2 倍體積的 SDS 上樣緩沖液混合，按每孔 20 μl 體積上樣進(jìn)行蛋白電泳，95 V 濕轉(zhuǎn) 45 min 至 NC 膜，NC 膜用 5%脫脂奶室溫封閉 2 h 后，0.1% PBST 洗 1 遍，加入大鼠抗 SRA（1:1000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日 0.1% PBST 洗膜 3 遍，加入 HRP-羊抗大鼠二抗（1:3000）37 ℃孵育 2 h，0.1% PBST 洗膜4 遍，進(jìn)行 ECL 發(fā)光檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 巖藻糖對(duì) BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化不同形態(tài) Aβ42的影響

按試劑盒要求，用ELISA 方法測(cè)細(xì)胞裂解液中 mAβ42和 oAβ42的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果表示為相對(duì)對(duì)照組（mAβ42或 oAβ42單獨(dú)孵育）的百分比（圖 1）。

2.2 巖藻糖對(duì)大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化不同形態(tài) Aβ42的影響

將 3 組大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞按方法 1.2.3 中實(shí)驗(yàn)步驟相同操作，結(jié)果見(jiàn)圖 2。

圖 1 巖藻糖對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞攝取 mAβ42（A）及 oAβ42（B）的影響（與Aβ42單獨(dú)處理組相比，*P < 0.05）

Figure 1 Effects of fucoidan on mAβ42(A) and oAβ42(B) uptake in BV2 microglia (compared with Aβ42treatmentalone,*< 0.05)

圖 2 巖藻糖對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞攝取 mAβ42（A）及 oAβ42（B）的影響（與Aβ42單獨(dú)處理組相比，*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 2 Effects of fucoidan on mAβ42(A) and oAβ42(B) uptake in astrocytes (compared with Aβ42treatmentalone,*< 0.05,**< 0.01)

2.3 Aβ42蛋白進(jìn)入膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光

為查明 Aβ42在小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞攝入后的胞內(nèi)分布情況，用 mAβ42孵育小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞 5 h，用共聚焦顯微鏡對(duì)mAβ42進(jìn)行細(xì)胞定位（圖 3A 和3B），并檢測(cè)了mAβ42處理兩種膠質(zhì)細(xì)胞 3 h，Aβ42孵育及Aβ42+ 巖藻糖持續(xù)阻斷 3 h 組的 Aβ42熒光（圖 3C），并做熒光強(qiáng)度對(duì)比（圖 3D）。結(jié)果顯示，清道夫受體阻斷劑巖藻糖不能阻止 mAβ42進(jìn)入小膠質(zhì)細(xì)胞，在巖藻糖持續(xù)存在的條件下，BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞攝取 mAβ42的熒光相比對(duì)照組顯著增強(qiáng)。

2.4 巖藻糖作用 BV2細(xì)胞后 MAPK 激酶家族磷酸化水平的測(cè)定

巖藻糖的存在使 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞吞入 mAβ42顯著增加，經(jīng)過(guò)巖藻糖（100 μg/ml）預(yù)處理的膠質(zhì)細(xì)胞攝取oAβ42的量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，而巖藻糖持續(xù)存在于實(shí)驗(yàn)體系的情況下，這種趨勢(shì)出現(xiàn)了明顯反轉(zhuǎn)，推測(cè)是巖藻糖作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)吞形式的轉(zhuǎn)變所致。因此在小膠質(zhì)細(xì)胞中測(cè)定了巖藻糖持續(xù)存在實(shí)驗(yàn)體系的條件下，MAPK 激酶家族（p38-MAPK、JNK、ERK）磷酸化的水平，以單獨(dú)細(xì)胞條件下細(xì)胞的磷酸化測(cè)定水平作為對(duì)照，結(jié)果（圖4）顯示巖藻糖環(huán)境下，應(yīng)激激活的蛋白激酶 p38-MAPK、JNK 磷酸化水平顯著高于空白細(xì)胞組及 oAβ42處理組。

2.5 膠質(zhì)細(xì)胞中清道夫家族受體表達(dá)量測(cè)定

小膠質(zhì)細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞在巖藻糖環(huán)境中表現(xiàn)出不同的mAβ42吞噬規(guī)律，推測(cè)是由于這兩種細(xì)胞中吞噬受體的表達(dá)差異造成[12-13]，于是分別測(cè)定了實(shí)驗(yàn)中兩種膠質(zhì)細(xì)胞主要司職病理蛋白吞噬的 SRA 與 SRB 受體[7]表達(dá)量。結(jié)果顯示，SRA、SRB 兩種清道夫受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中均高度表達(dá)，而星型膠質(zhì)細(xì)胞中僅檢測(cè)到 SRB 受體表達(dá)（圖5）。

2.6 小膠質(zhì)細(xì)胞 SRA 蛋白的檢測(cè)

進(jìn)一步對(duì)在 BV2 細(xì)胞中表達(dá)的 SRA 受體進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，該受體屬于同源三聚體跨膜糖蛋白，由于在 RIPA 裂解液中只能檢測(cè)到極微弱的 SRA 條帶，采用膜蛋白提取試劑盒得到富集的 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，GADPH 為內(nèi)參蛋白。結(jié)果顯示，60 kD 處的 SRA 受體單個(gè)亞基條帶，及 190 kD 左右為 SRA 受體全長(zhǎng)條帶。在2B提取液中可以檢測(cè)到富集的 SRA 受體條帶以及 190 kD 處的 SRA 全長(zhǎng)條帶，在作用柔和的2A提取液中，僅能觀察到 SRA亞基條帶，證實(shí)了該受體為典型的胞膜蛋白成分（圖 6）。

圖 3 共聚焦成像顯示 mAβ42在膠質(zhì)細(xì)胞的分布（A：小膠質(zhì)細(xì)胞；B：星型膠質(zhì)細(xì)胞；C：小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組 + Aβ42孵育 + Aβ42巖藻糖共同孵育，比例尺 10 μm；D：圖 3C 的各組細(xì)胞Aβ42熒光強(qiáng)度對(duì)比，**P < 0.01）

Figure 3 Confocal laser scanning of mAβ42in glia cells (A: Microglia; B: Astrocytes; C: Control /Aβ42/Aβ42+ Fucoidan, scale bars = 10 μm; D: Optical density of figure 3C, compared with Aβ42,**< 0.01)

3 討論

僅 5% 的早發(fā)性 AD（遺傳因素造成）為患者腦內(nèi) Aβ 生成增加所致[14]，其余 95% 的晚發(fā)性 AD 中，如何使腦內(nèi) Aβ 的生成與清除達(dá)到平衡是治療的關(guān)鍵[15]。膠質(zhì)細(xì)胞一方面可吞噬降解 Aβ，另一方面造成吞噬后過(guò)度激活產(chǎn)生致炎因子引發(fā)炎癥，從而造成神經(jīng)元損傷[16]，將膠質(zhì)細(xì)胞保持在趨化性和激活程度適中的、未衰老的有益狀態(tài)對(duì)于 AD 的免疫治療至關(guān)重要[17]。

本研究通過(guò)巖藻糖對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞表面清道夫受體的占位性阻滯和細(xì)胞信號(hào)激活的雙重作用探討了其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞吞入 Aβ42蛋白的影響：巖藻糖作為膠質(zhì)細(xì)胞表面清道夫家族受體的占位性配體，并不能單純依靠受體阻斷作用阻止mAβ42進(jìn)入 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步地，持續(xù)存在實(shí)驗(yàn)體系中（3 h）的巖藻糖致使近對(duì)照組兩倍的 mAβ42攝入細(xì)胞，提示mAβ42并不完全由受體激發(fā)的吞噬途徑介導(dǎo)進(jìn)入小膠質(zhì)細(xì)胞：該實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)激相關(guān)的激酶 p38-MAPK 與 JNK 磷酸化程度顯著升高，上述激酶同時(shí)出現(xiàn)在膠質(zhì)細(xì)胞胞飲信號(hào)通路中 PI3 激酶的下游[18]，膠質(zhì)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重組過(guò)程依賴 p38-MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活[19]，因此 p38-MAPK的激活參與了膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)mAβ42的巨胞飲過(guò)程，該結(jié)果與并不表達(dá) SRA 受體的大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞相反，推測(cè) SRA 受體的存在是上述結(jié)果的主要原因。兩種膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)巖藻糖預(yù)處理后，對(duì)oAβ42的吞噬量均顯著下降，說(shuō)明即使巖藻糖被從實(shí)驗(yàn)環(huán)境洗脫，該分子仍可能黏附于膠質(zhì)細(xì)胞表面清道夫家族受體起到占位性阻斷作用，使得高聚集形態(tài)的 Aβ42進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程受到抑制。

圖 4 巖藻糖或 oAβ42作用 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞MAPK 磷酸化水平的影響（與單獨(dú)細(xì)胞測(cè)定組及 oAβ42孵育組相比，**P < 0.01）

Figure 4 Level of MAPK-phosphorylation after sustain-incubate by fucoidan or oAβ42(compared with cell alone and cells treated with oAβ42,**< 0.01)

膠質(zhì)細(xì)胞在 AD 進(jìn)程中扮演的角色一直備受爭(zhēng)議[20]。AD 晚期患者腦組織內(nèi)可存在大量圍繞小膠質(zhì)細(xì)胞的不溶性 Aβ 蛋白斑塊并伴隨慢性的炎癥狀態(tài)：小膠質(zhì)細(xì)胞一方面可吞噬降解 Aβ，另一方面造成吞噬后過(guò)度激活產(chǎn)生致炎因子引發(fā)炎癥，從而造成神經(jīng)元損傷，衰老的膠質(zhì)細(xì)胞喪失了吞噬和消化病理蛋白的能力[21]，導(dǎo)致其攜帶吞入的病理蛋白斑塊聚集使病灶擴(kuò)展，當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞表面吞噬受體與帶有病原相關(guān)分子模式（細(xì)菌或病理性蛋白的特定結(jié)構(gòu)）的配體結(jié)合并經(jīng)清道夫 SRA 受體途徑迅速吞入，可降低胞膜表面 TLR4 等感應(yīng)性受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使得膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬異物時(shí)不至于過(guò)度激活而留存活力[22]。膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)單體形態(tài) Aβ的內(nèi)化過(guò)程將有助于腦脊液外周沉沒(méi)機(jī)制對(duì)于腦實(shí)質(zhì)內(nèi) Aβ 高聚物負(fù)載的清除[23]。本研究證實(shí)，MAPK 激酶活化水平的提高可增強(qiáng) Aβ42由胞飲作用進(jìn)入小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，腦內(nèi)此過(guò)程的發(fā)生將有益于不溶性 oAβ42的清除，巖藻糖的預(yù)阻斷作用占位性抑制mAβ42進(jìn)入星型膠質(zhì)細(xì)胞，但在高度表達(dá) SRA 受體的小膠質(zhì)細(xì)胞中，推測(cè)巖藻糖預(yù)處理引發(fā)的 MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)誘發(fā)的吞飲過(guò)程掩蓋了小膠質(zhì)細(xì)胞表面黏附的巖藻糖分子對(duì) mAβ42吞入阻斷作用，且?guī)r藻糖的持續(xù)存在可使此吞飲過(guò)程進(jìn)一步增強(qiáng)，而缺失 SRA 受體的星型膠質(zhì)細(xì)胞中沒(méi)有觀察到此實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)條件下與細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 ERK 磷酸化程度顯著降低，展現(xiàn)與同家族應(yīng)激激活的蛋白激酶 p38-MAPK 及 JNK 激酶的磷酸化程度變化相反的趨勢(shì)，其具體意義有待進(jìn)一步查明。SRA 受體是清除腦內(nèi) Aβ42的主要受體，隨著年齡的增長(zhǎng)，SRA 基因的腦內(nèi)表達(dá)量會(huì)漸進(jìn)性下調(diào)，而細(xì)胞在體外受到前炎性介質(zhì)刺激時(shí)，SRA 基因也會(huì)出現(xiàn)下調(diào)[24]，提示該受體是衰老相關(guān)的炎癥狀態(tài)與 AD 發(fā)病間的紐帶。本實(shí)驗(yàn)中，兩種膠質(zhì)細(xì)胞受體表達(dá)譜的差異是造成兩種膠質(zhì)細(xì)胞吞入 Aβ42蛋白規(guī)律存在顯著差異的原因。

圖 5 反轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的SRA、SRB 基因表達(dá)（A：大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞；B：小膠質(zhì)細(xì)胞；C：大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增曲線；D：小膠質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增曲線）

Figure 5 Gene expression and amplification curve of SRA，SRB in glia cells detected by reverse transcriptional PCR (A: Rat astrocytes; B: BV2 microglia; C: Amplification curve of rat astrocytes; D: Amplification curve of BV2 microglia)

圖 6 膜蛋白提取液與 RIPA 裂解液中的 SRA 受體檢測(cè)

Figure 6 Prepared membrane protein extractions of BV2 cells were identified by Western blot for mouse SRA

本研究利用巖藻糖為研究工具探索了兩類膠質(zhì)細(xì)胞與 Aβ42蛋白的相互作用及攝取機(jī)制，在膠質(zhì)細(xì)胞中證實(shí)了巖藻糖作為其表面清道夫受體阻斷劑與吞飲過(guò)程激活劑的雙重作用及其效應(yīng)隨作用時(shí)間的變化，具體實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)用的提前洗脫受體阻斷劑的實(shí)驗(yàn)操作方式尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，可為膠質(zhì)細(xì)胞吞噬病理性蛋白相關(guān)的受體理論研究提供參考。

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Effects of fucoidan on the internalization of Aβ42in glia cells

ZHANG He

Department of Pharmacy, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China, Email: zhanghe0718@sina.com

This research aims to demonstrate the internalization process of different Aβ42aggregation forms in glia cells upon the influence of fucoidan.

Aβ42uptake quantity in glia cells with or without fucoidan influence were measured. MAPK phosphorylation level was detected in fucoidan-activated microglia. The expression of scavenger receptor A and scavenger receptor B in two lines of glias were explored.

The intracellular monomer Aβ42(mAβ42) was significantly increased in fucoidan pre-treated and persistently-treated BV2 microglia. The mAβ42uptake in rat astrocytes and oligomer Aβ42uptake in BV2 microglia and rat astrocytes were reduced upon pre-treatment with fucoidan, while the above-mentioned effects were restored following persistent treatment of fucoidan. The expression of SRA and SRB scavenger receptor were observed in BV2 microglia, while only SRB expression was found in rat astrocytes, based on PCR analysis. p38-MAPK phosphorylation was increased and pinocytosis process of Aβ42wasenhanced in BV2 microglia following persistent treatment of fucoidan.

The interaction mode between fucoidan and heterogeneous glia receptors might exert influence on internalization process of different Aβ42aggregate forms in the glia cells. SRA may be involved in Aβ42phagocytosis promoted by p38-MAPK. These findings describe a common molecular cue important for Aβ phagocytosis in glia cells and provide insight into the glia-related immunotherapy in Aβ clearance.

Microglia; Astrocytes; Internalization; Fucoidan; Surface phagocytic receptor; Alzheimer disease

北京市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)“老年重大疾病關(guān)鍵技術(shù)研究”（PXM 2018-026283-000002）

2018-07-11

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.005