譚亞軍，夏德菊，李喆，晁哲，田霖，董國霞，侯啟明，馬霄

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白喉和破傷風(fēng)類毒素抗原ELISA檢測方法的建立

譚亞軍，夏德菊，李喆，晁哲，田霖，董國霞，侯啟明，馬霄

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室/衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

建立定量檢測白喉和破傷風(fēng)類毒素抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法。

分別采用白喉、破傷風(fēng)單抗包被酶標(biāo)板，兔抗白喉、破傷風(fēng)多抗作為二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體作為酶標(biāo)抗體，以平行線法建立定量檢測白喉和破傷風(fēng)類毒素抗原含量的夾心 ELISA 法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

兩種定量檢測 ELISA 方法的驗(yàn)證結(jié)果均符合規(guī)定。檢測白喉類毒素抗原 ELISA 方法的定量限為 8.90 ×10-4Lf/ml，回收率為 98.35%，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤ 10.59%，批間 CV ≤ 13.51%；檢測破傷風(fēng)類毒素抗原 ELISA 方法的定量限為 2.13 × 10-3Lf/ml，回收率為 107.28%，批內(nèi) CV ≤ 13.96%，批間 CV ≤ 10.06%。

建立了白喉、破傷風(fēng)類毒素抗原 ELISA 檢測方法，該法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于白喉破傷風(fēng)疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制和生產(chǎn)過程控制。

白喉； 破傷風(fēng)； 抗原； 白喉-破傷風(fēng)菌苗； 酶聯(lián)免疫吸附測定

白喉和破傷風(fēng)疫苗作為計(jì)劃免疫品種，在我國得到了廣泛應(yīng)用，可以有效預(yù)防白喉、破傷風(fēng)疾病，疫苗的基礎(chǔ)組成分別是白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）和破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）。兩種疫苗的生產(chǎn)工藝基本相同，方法較為傳統(tǒng)，均為細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生的毒素經(jīng)精制、甲醛脫毒成類毒素，再加入鋁佐劑吸附制成。除作為疫苗使用外，近年隨著國內(nèi)外細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的發(fā)展，類毒素因其良好的免疫原性已成為應(yīng)用最多的蛋白載體[1-2]。

目前的 2015 年版《中國藥典》三部規(guī)定白喉和破傷風(fēng)類毒素抗原含量的檢測方法是采用絮狀沉淀法[3]，以絮狀單位（flocculation units，Lf）表示，該方法操作較為復(fù)雜，人工終點(diǎn)判斷較難掌握。我們利用類毒素免疫新西蘭大白兔制備多抗，半固體培養(yǎng)基法制備單克隆抗體，以平行線法建立了白喉和破傷風(fēng)類毒素的夾心酶聯(lián)免疫測定法。該方法可用于白喉破傷風(fēng)疫苗的鑒別試驗(yàn)、組分含量測定、吸附度測定等質(zhì)量控制項(xiàng)目以及疫苗生產(chǎn)過程監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品 白喉類毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品（02/176）和破傷風(fēng)類毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品（04/150）由英國國家生物制品檢定所提供[4]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c 小鼠由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所提供，生產(chǎn)許可證號 SYXK（京）2016-0004，飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣動物籠環(huán)境。

1.1.3 主要試劑及儀器 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG 為美國 Life Technologies 公司產(chǎn)品；96 孔酶標(biāo)板為德國 Greiner 公司產(chǎn)品；底物鄰苯二胺（OPD）、牛血清白蛋白（BSA）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純；Spectramax PLUS 酶標(biāo)儀為美國 Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單抗的制備和純化 用白喉、破傷風(fēng)抗原加弗氏完全佐劑，經(jīng)皮下注射 8 周齡BALB/c 雌性小鼠，每種抗原免疫 5 只小鼠，30 μg/只，3 周后，再以 30 μg/只抗原加弗氏不完全佐劑經(jīng)腹腔注射小鼠，7 ~ 10 d 后眼眶取血，采用間接 ELISA 法檢測血清抗體效價(jià)，每種抗原分別取效價(jià)最高且大于 1:104的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。第二次免疫 3 周后，于融合前 3 天經(jīng)尾靜脈注射抗原30 μg/只加強(qiáng)免疫。無菌采取小鼠的脾臟細(xì)胞與對數(shù)期生長的 SP2/0 細(xì)胞按 5:1 ~ 10:1 比例，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[5]，將融合后的細(xì)胞與 1.1% 甲基纖維素培養(yǎng)液混勻，鋪入 6 孔板中，平行鋪 3 板。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)期間避免觀察或動板，以免融合細(xì)胞移動位置。8 ~ 11 d 后肉眼可見針尖大小白色斑點(diǎn)，顯微鏡下觀察即為細(xì)胞克隆團(tuán)，挑取后直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的 96 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。用 ELISA 間接法檢測上清抗體效價(jià)，獲取分泌高效價(jià)抗體的雜交瘤細(xì)胞株[6]。按常規(guī)方法制備小鼠雜交瘤細(xì)胞腹水，先用辛酸-硫酸銨沉淀法粗提腹水，然后將粗提液經(jīng) A 蛋白親和層析柱進(jìn)行純化[7]。

1.2.2 多抗的制備和純化 用 PBS 緩沖液稀釋白喉、破傷風(fēng)類毒素抗原至 2 mg/ml，與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射 12 周齡、體重 2.5 ~ 3 kg 的雌性家兔，每組抗原免疫 2 只家兔，1 mg/只，以后每隔 2 周以抗原加弗氏不完全佐劑經(jīng)皮下進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫 4 次，于最后一次免疫一周后，耳部靜脈取血，分離血清。用 ELISA 間接法檢測每份血清抗體效價(jià)，每組選取抗體效價(jià)高的家兔血清用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化。

1.2.3 夾心 ELISA 法的建立

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 應(yīng)用方陣滴定法分別確定白喉和破傷風(fēng)包被單抗、檢測多抗的最佳工作濃度，酶標(biāo)二抗的工作濃度為 1:60 000。將包被抗體用 pH 9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋至確定的包被濃度，以 100 μl/孔包被 ELISA 板，4 ℃ 過夜。用 0.5% BSA 封閉，37 ℃ 1 h 后，洗滌。然后加入

等體積一系列不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品（白喉為 0 ~ 0.4 Lf/ml，破傷風(fēng)為 0 ~ 0.4 Lf/ml），每個(gè)濃度均作復(fù)孔，100 μl/孔，用于確定兩種抗原檢測方法的檢測線性范圍。37 ℃ 1 h 后洗滌。按確定的濃度加入檢測多抗，100 μl/孔，37 ℃ 1 h 后洗滌。按工作濃度（1:60 000）加入檢測酶標(biāo)二抗，100 μl/孔，37 ℃ 1 h 后洗滌。加 OPD 底物顯色，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定 490 nm 下的吸光度（）。以抗原標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 方法學(xué)驗(yàn)證 對供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線同時(shí)進(jìn)行擬合，以平行線法定量檢測白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素抗原含量。①特異性：用建立的 ELISA 方法檢測白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳毒素、絲狀血凝素、黏附素，分別評價(jià)兩種方法的特異性。②定量限：以白喉抗原國際標(biāo)準(zhǔn)品0.0015625、0.00078、0.00039、0.000195 Lf/ml 四個(gè)稀釋濃度的樣品作為待測樣品，0.05 Lf/ml 稀釋濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品；破傷風(fēng)抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品 0.00625、0.003125、0.0015625、0.00078 Lf/ml 四個(gè)稀釋濃度的樣品作為待測樣品，0.1 Lf/ml 稀釋濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，依次加入已包被抗體的酶標(biāo)板 A 排中，待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行 2 倍系列稀釋至第八孔，應(yīng)用已建立的 ELISA 方法，分別測定各樣品抗原含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定 6 次。計(jì)算每個(gè)樣品測定結(jié)果與理論值的偏差，以確定檢測方法的定量限。③準(zhǔn)確度：在零濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別添加已知的白喉類毒素標(biāo)準(zhǔn)品 0.01 Lf/ml 和破傷風(fēng)類毒素 0.02 Lf/ml，再進(jìn)行 ELISA 檢測，并計(jì)算含量，根據(jù)公式：回收率（%）= 測得值/ 真實(shí)值 × 100% 得出準(zhǔn)確度。④精密度：選取高、低濃度的白喉抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.025 Lf/ml，0.00625 Lf/ml）和破傷風(fēng)抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 Lf/ml，0.0125 Lf/ml），每份標(biāo)準(zhǔn)溶液同批測定 10 次，重復(fù)試驗(yàn) 3 次，計(jì)算測定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，得出批內(nèi)變異系數(shù)（CV）和批間 CV，評價(jià)方法的精密度。

2 結(jié)果

2.1 最佳工作濃度的確定

方陣滴定法結(jié)果顯示，采用白喉單抗 D09A07 和破傷風(fēng)單抗 T3C10 作為包被抗體時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線有較大的斜率，并確定了兩種抗原 ELISA 檢測方法中包被單抗、檢測多抗的最佳工作濃度分別為 3 μg/ml 和 1 μg/ml。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以類毒素抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（白喉為 0 ~0.05 Lf/ml；破傷風(fēng)為 0 ~ 0.1 Lf/ml）為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行四參數(shù)擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖 1 和圖 2。檢測白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素抗原的 ELISA 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線四參數(shù)方程分別為 Y =（–0.012 – 1.796）/[1 +（x / 0.004）?0.862]+ 1.796，相關(guān)系數(shù)2為 0.999；Y =（0.104 – 1.735）/[1 +（x / 0.022）?1.177]+ 1.735，相關(guān)系數(shù)2為 0.993。結(jié)果證實(shí)白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素抗原濃度與相應(yīng)值在檢測范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，表明了兩種 ELISA 檢測方法的可靠性。

圖 1 白喉類毒素 ELISA 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 1 Standard curve of diphtheria toxoid by ELISA assay

圖 2 破傷風(fēng)類毒素 ELISA 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 2 Standard curve of tetanus toxoid by ELISA assay

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 特異性 用建立的 ELISA 方法檢測白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳毒素、絲狀血凝素、黏附素，結(jié)果表明白喉抗原 ELISA 檢測方法除了與白喉類毒素反應(yīng)，對其他四種物質(zhì)均無交叉反應(yīng)；破傷風(fēng)抗原 ELISA 檢測方法除了與破傷風(fēng)類毒素反應(yīng)，對其他四種物質(zhì)均無交叉反應(yīng)。

2.3.2 定量限 測定不同濃度的白喉類毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品和破傷風(fēng)類毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)檢測結(jié)果與理論值偏差≤ 20% 的最低稀釋濃度來確定方法的定量限。當(dāng)白喉類毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至 7.81 × 10-4Lf/ml 時(shí)檢測偏差為 13.90%，稀釋至 3.91 × 10-4Lf/ml 時(shí)檢測偏差> 20%，因此檢測白喉類毒素抗原的定量限為 8.90 × 10-4Lf/ml。當(dāng)破傷風(fēng)類毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至 3.13 × 10-3Lf/ml 時(shí)檢測偏差為 7.56%，稀釋至 1.56 × 10-3Lf/ml 時(shí)檢測偏差> 20%，因此檢測破傷風(fēng)類毒素抗原的定量限為 2.13 × 10-3Lf/ml（表 1 和表 2）。

2.3.3 準(zhǔn)確度 回收試驗(yàn)結(jié)果顯示檢測白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素兩種 ELISA 檢測方法的回收率分別為 98.35% 和 107.28%，符合規(guī)定。

2.3.4 精密度 試驗(yàn)結(jié)果顯示，白喉類毒素的 ELISA 檢測方法在高濃度時(shí)，平均批內(nèi) CV 和批間 CV 分別為 8.74% 和 9.68%，低濃度時(shí)平均批內(nèi)CV 和批間 CV 分別為 10.59% 和 13.51%；破傷風(fēng)類毒素的 ELISA 檢測方法在高濃度時(shí)平均批內(nèi)CV 和批間 CV 分別為 12.35% 和 5.24%，低濃度時(shí)平均批內(nèi) CV 和批間 CV 分別為 13.96% 和 10.06%，符合規(guī)定。

表 1 白喉類毒素 ELISA 檢測方法的定量限驗(yàn)證結(jié)果

表 2 破傷風(fēng)類毒素 ELISA 檢測方法的定量限驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

白喉是一種由白喉棒狀桿菌引起的急性上呼吸道傳染病，人群對白喉普遍易感，以兒童為多。破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌感染引起的嚴(yán)重感染性疾病，目前在大部分發(fā)展中國家仍然是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，世界范圍內(nèi)每年死于破傷風(fēng)的人群 80% 為新生兒[1-2]。預(yù)防白喉和破傷風(fēng)最有效的手段是對嬰幼兒和高危人群實(shí)施疫苗的免疫接種。目前國內(nèi)外使用的白喉和破傷風(fēng)疫苗均為細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素經(jīng)精制、甲醛脫毒后制成的類毒素疫苗。不具有外毒素的毒性，但保留了其免疫原性，能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異的保護(hù)性抗體，通過對人群的廣泛接種可有效降低疾病的發(fā)病率和死亡率。

有效抗原的含量測定是疫苗質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。目前白喉和破傷風(fēng)類毒素疫苗的抗原含量檢測方法是利用類毒素與相應(yīng)抗毒素在適當(dāng)?shù)暮?、比例、溫度、反?yīng)時(shí)間等條件下，發(fā)生抗原抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的絮狀凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行，以絮狀單位表示，該方法操作需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員完成，終點(diǎn)判斷存在一定人員誤差。

本研究利用抗白喉、破傷風(fēng)單克隆抗體作為包被抗體，兔抗白喉、破傷風(fēng)多抗作為二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體作為酶標(biāo)抗體，建立了定量檢測白喉和破傷風(fēng)類毒素含量的夾心 ELISA 方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，這兩種 ELISA方法的特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，方法操作 簡單，易于推廣，可廣泛用于白喉破傷風(fēng)疫苗的質(zhì)量控制和生產(chǎn)過程控制，包括鑒別試驗(yàn)、抗原含量測定、吸附度測定等疫苗質(zhì)控關(guān)鍵項(xiàng)目，對提高我國白喉和破傷風(fēng)類毒素疫苗的質(zhì)量有重要的實(shí)際意義。

[1] Plotkin S, Orenstein W, Offit P. Vaccines (Plotkin). 7th ed. Philadelphia, PA: Elsevier, 2012:153-166, 746-772.

[2] Zhao K, Zhang YH, Li HM. Medical biological products. 2nd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2007:692-702, 975-1005. (in Chinese)

趙鎧, 章以浩, 李和民. 醫(yī)學(xué)生物制品學(xué). 2版. 中國: 人民衛(wèi)生出版社, 2007:692-702, 975-1005.

[3] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 3, 2010. Beijing: China Medical Science Press, 2010. (in Chinese)

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 2010年版三部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[4] Preneta-Blanc R, Rigsby P, Wilhelmsen ES, et al. Calibration of replacement international standards of diphtheria and tetanus for use in flocculation test. Biologicals, 2008, 36(5):315-326.

[5] Zhou CF. Prokaryotic expression, antibody preparation and preliminary application of influenza A virus (H1N1) (2009). Zhengzhou: Henan University of Technology, 2011. (in Chinese)

周春峰. 甲型H1N1(2009)流感病毒HA的原核表達(dá)、抗體制備及初步應(yīng)用. 鄭州: 河南工業(yè)大學(xué), 2011.

[6] Ren RM, Wang YL, Zhang YQ, et al. The improved intrasplenic immunization and semi-solid medium to prepare monoclonal antibody. Biotechnol Bull, 2013, 29(8):166-169. (in Chinese)

任瑞敏, 王云龍, 張怡青, 等. 利用改良后的脾內(nèi)免疫和半固體培養(yǎng)基法制備單克隆抗體. 生物技術(shù)通報(bào), 2013, 29(8):166-169.

[7] Liu XB, Cai MY, Wang X, et al. One simple and efficient method for purification of IgG McAb from mice ascites: caprylic acid/ ammonium sulfate precipitation. J West China Univ Med Sci, 1999, 30(4):455-456, 464. (in Chinese)

劉曉波, 蔡美英, 王霞, 等. 一種簡單實(shí)用純化腹水McAb方法——辛酸/硫酸銨法. 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 30(4):455-456, 464.

Establishment of ELISA assays for determination of the diphtheria toxoid and tetanus toxoid

TAN Ya-jun, XIA De-ju, LI Zhe, CHAO Zhe, TIAN Lin, DONG Guo-xia, HOU Qi-ming, MA Xiao

Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

This study aims to establish two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methods for quantitative determination of the diphtheria toxoid (DT) and tetanus toxoid (TT), respectively.

The assay system was based on the sandwiching of the antigen between a monoclonal mouse anti-DT or anti-TT antibody pre-coated on a 96-well polystyrene plate, and a polyclone rabbit anti-DT or anti-TT antibody, which was then detected with a peroxidase-labeled goat anti-rabbit antibody. Then the two ELISA assays with parallel lines were validated.

Validation results of the two quantitative ELISA methods were in accordance with the regulations. The limit of quantity of ELISA method for quantitative detection of DT was demonstrated to be 8.90 × 10-4Lf/ml, and its average recovery rate was 98.35%. The intra-assay coefficient of variation (CV) and inter-assay CV of this DT assay were less than or equal to 10.59%, and 13.51%,respectively. The limit of quantity of ELISA method for quantitative detection of TT was also demonstrated to be 2.13 × 10-3Lf/ml, and its average recovery rate was 107.28%. The intra-assay CV and inter-assay CV of this TT assay were less than or equal to 13.96% and 10.06%, respectively.

The two ELISA methods for quantitative determination of the diphtheria toxoid and tetanus toxoid are specific, accurate and reproducible, which may be used for the quality control of diphtheria and tetanus vaccines and production process control.

Diphtheria; Tetanus; Antigen; Diphtheria-tetanus vaccine; Enzyme-linked immunosorbent assay

MA Xiao, Email: maxiao421@sina.cn; XIA De-ju, Email: xiaju2007@126.com

“十三五”國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09738005）

馬霄，Email：maxiao421@sina.cn；夏德菊，Email：xiaju2007@126.com

2018-06-29

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.002