宮曉紅，王丹，沈宗坤，賈莉，劉鈴

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microRNA-20a靶向調控唾液酸轉移酶ST8SIA2在結直腸癌耐藥中的作用

宮曉紅，王丹，沈宗坤，賈莉，劉鈴

116013 遼寧，大連中醫(yī)醫(yī)院檢驗科（宮曉紅）；114002 遼寧，鞍鋼集團公司總醫(yī)院檢驗科（王丹）；123000 遼寧，阜新中心醫(yī)院檢驗科（沈宗坤）；116044 遼寧，大連醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院（賈莉）；118000 遼寧，丹東市第一醫(yī)院檢驗科（劉鈴）

探究基于 miR-20a 為探針調控 ST8SIA2 在結直腸癌耐藥中的功能和機制，為尋求逆轉藥物提供新的治療策略及靶點。

采用 RT-PCR、Western blot 分別檢測結直腸癌 Lovo 細胞及其耐藥細胞株 Lovo/5-FU 中 miR-20a、ST8SIA2 的表達水平；利用 CCK-8 及 Western blot 實驗檢測上調、下調 miR-20a 后兩種細胞株的藥物敏感性及其 ST8SIA2 的表達情況；靶基因預測及雙熒光素酶報告實驗驗證 miR-20a 與 ST8SIA2的靶向關系；利用 CCK-8 實驗進一步檢測 Lovo 細胞中 miR-20a 和 ST8SIA2 表達調控對細胞藥物敏感性的影響。

①與 Lovo 細胞相比，miR-20a 在耐藥細胞株 Lovo/5-FU 中呈現(xiàn)高表達，ST8SIA2 呈現(xiàn)低表達；②特異性上調 Lovo 細胞中 miR-20a 表達，ST8SIA2 表達減弱，該細胞的藥物敏感性減弱；③特異性下調 Lovo/5-FU 細胞中 miR-20a 表達，ST8SIA2 表達增加，該細胞的藥物敏感性增強；④特異性上調 Lovo 細胞中 ST8SIA2 表達，可逆轉 miR-20a 對細胞產生的作用。

miR-20a 及 ST8SIA2 的表達水平與結直腸癌耐藥性密切相關，miR-20a 可能是通過靶向負調控ST8SIA2 的表達進而調控結直腸癌細胞的耐藥。

結直腸腫瘤； miR-20a； ST8SIA2； 抗藥性，腫瘤

結直腸癌是人類高發(fā)的惡性腫瘤之一，是全球第二位癌癥相關死亡原因[1]。臨床中一些結直腸癌患者在數(shù)次化療后會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和進展，腫瘤細胞產生的耐藥是導致化療失敗的主要原因，增加結直腸癌細胞的化療敏感性尤為重要。

微小 RNAs（miRNAs）與惡性腫瘤的關系是近年來研究的熱點。miRNAs 可通過翻譯抑制或基因降解來調節(jié)基因表達[2]。研究表明，miR-20a 在結直腸癌的增殖、侵襲及上皮間質轉化過程中起重要作用[3-4]。近年來研究表明，唾液酸糖基化修飾與腫瘤及其耐藥有著密切的聯(lián)系，但引起腫瘤的耐藥機制尚未明確。本文旨在探討 miR-20a 及唾液酸轉移酶 ST8SIA2 與結直腸癌耐藥的關系，從而為結直腸癌的治療提供新的策略及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 結直腸癌細胞株 Lovo 及人胚腎細胞株 293T（雙熒光素酶報告實驗用）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）購自美國 Sigma 公司；CCK-8 試劑購自美國 Selleck 公司；PVDF 膜購自美國 Pall 公司；兔抗鼠 ST8SIA2 多克隆抗體和兔抗鼠 GAPDH 多克隆抗體均購自英國 Abcam 公司；ECL 發(fā)光試劑盒及Quanti Tect Reverse Transcription Kit 購自美國 Thermal Fisher Scientific公司；Trizol 試劑、LipofectamineTM2000 及 ST8SIA2 pEGFP-N2 vector 均購自美國 Invitrogen 公司；miR-20a mimic/inhibitor 購自廣州銳博公司；雙熒光素酶報告質粒 pmirGLO 購自吉瑪公司；DYY-12 型電泳儀購自北京六一儀器廠；RT-PCR 儀購自 Takara 公司；酶標儀購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司；BM-66XB 型倒置熒光生物顯微鏡購自日本 Olympus 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國 Thermo 公司；低溫冰箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用 10% 體積的熱滅活胎牛血清，1% 體積的青霉素（100 μg/ml）、鏈霉素（100 μg/ml），90% 體積的 DMEM 培養(yǎng)基制成 Lovo 細胞培養(yǎng)液。取 10 ml 該培養(yǎng)液培養(yǎng) Lovo 細胞于培養(yǎng)瓶中，并置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。采用藥物濃度遞增誘導法建立 Lovo 的耐藥細胞株，5-FU 藥物梯度由 0.1 逐漸到 2 μg/L 培養(yǎng)半年左右，以此得到的細胞株命名為 Lovo/5-FU，為了維持其耐藥性，該細胞株在含 2 μg/L的 5-FU 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實驗前需停藥培養(yǎng)一周。

1.2.2 RNA 提取和 Real-time PCR 用 Trizol 法直接提取 Lovo、Lovo/5-FU 細胞的總 RNA。使用紫外分光光度計檢測所提取的總 RNA 濃度和純度。將提取的 RNA 按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。反轉錄體系為 20 μl，分別在 25 ℃反應5 min，在 42 ℃反應 60 min，在70 ℃反應 5 min。將上述反轉錄得到的 cDNA 按照 SYBR Premix Ex Taq II加樣體系，置于 Real-time PCR 儀進行實時定量 PCR 擴增。反應體系總體積為 25 μl，分別在 95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火。延長 30 s，總共 40 個擴增循環(huán)。整個實驗過程重復進行 3 次。

1.2.3 免疫印跡分析 用 Lysis Buffer 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，通過蛋白定量分析試劑盒定量蛋白質。蛋白上樣前先煮沸 3 ~ 5 min 使其變性，用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白。每孔上樣量 40 μg 進行電泳，直到蛋白 marker 在 12% 的分離膠中完全分開。將目的蛋白所在位置的凝膠切下，通過轉膜儀將凝膠上的目的蛋白轉移到 PVDF 膜上。轉膜完成后，將膜放入 5% 脫脂牛奶（TTBS 配制）中，置于 37 ℃封閉 2 h。再分別與兔抗鼠 ST8SIA2（1:1000），GAPDH（1:1000）多克隆抗體 4 ℃孵育過夜。第二天取出 37 ℃搖膜 2 h，PBS 洗膜 4 次，每次 8 min。加 HRP 標記的羊抗兔 IgG（1:5000），于 37 ℃孵育 1.5 h，再洗膜 4 次，每次 8 min。用 ECL 發(fā)光試劑盒顯示條帶，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參進行對照分析。

1.2.4 體外藥敏分析 采用 CCK-8 法檢測Lovo、Lovo/5-FU 及轉染 miR-20a 后結直腸癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。取生長對數(shù)期細胞懸液 100 μl（5 × 104個/ml）接種于 96 孔培養(yǎng)板中，待其貼壁完全后，于各孔中分別加入 10 μl 相應藥物濃度的 5-FU。繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 后，加入 11 μl 的 CCK-8 試劑，孵育 4 h 后，于 450 nm 處檢測其吸光度值。實驗中每個 96 孔板中設置一組陰性對照孔（不加細胞，其他試劑正常加），每種細胞對 5-FU 藥物設置一組陰性對照孔（不加藥，其他試劑正常加），陰性對照及實驗孔均做 5 個復孔。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 設計與 miR-20a-5p 相結合的 ST8SIA2 的 3'UTR 序列以及突變序列，并分別將其構建到雙熒光素酶報告基因載體 pmirGLO 上（由上海吉瑪公司合成）。取對數(shù)生長期的 293T 細胞，胰酶消化，重懸細胞至 15 × 104/ml，取 500 μl 接種于 24 孔板，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。棄培養(yǎng)基，加入 500 μl 無血清培養(yǎng)基。根據(jù)所加質粒和 RNA 的不同，共分 6 組（空質粒 control-ST8SIA2 + miR-20a mimic，空質粒 control-ST8SIA2 + miR-20a control，野生型質粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic，野生型質粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control，突變型質粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic，突變型質粒 mu-ST8SIA2 + miR-20a control），每組 4 個副孔。先在 EP 管中配好每孔所需物質，即 100 μl無血清培養(yǎng)基，4 μl 質粒（0.1 μg/μl），1 μl RNA（20 pmol/μl），2 μl Lip2000，混勻，室溫靜置20 min，之后分別加入相應孔板中。48 h 后，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，裂解細胞，取細胞裂解液至 96 孔板，分別加入底物，進行螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性（作為內參）檢測。比較野生型質粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組相對于野生型質粒 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 組的螢火蟲熒光素酶活性變化量（經海腎熒光素酶活性標準化后）。

1.2.6 免疫熒光分析 Lovo、Lovo/5-FU 細胞轉染 miR-20a mimic/inhibitor 后進行免疫熒光實驗，檢測轉染后 ST8SIA2 的表達。將上述細胞分別接種至小平皿中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜。第2 天貼壁后取出，PBS 清洗，用 10% 甲醛固定40 min。PBS 洗 3 次，加入 0.1% 的 Triton X-100 透化 5 min，用5% 的 BSA 室溫封閉 1 h。接著細胞與兔抗鼠特異性 ST8SIA2（1:1000）抗體 4 ℃孵育過夜。次日，平皿取出復溫 1 h，接著孵育二抗（1:400），在 37 ℃避光孵育 30 min。PBS 清洗 3 次，將樣品覆蓋 DAPI，室溫避光放置 10 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 miR-20a 和 ST8SIA2 在 Lovo 細胞及其耐藥細胞株中的差異表達

采用 RT-PCR 檢測 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞株中 miR-20a 和 ST8SIA2 的表達水平，采用 Western blot 檢測在兩細胞株中 ST8SIA2 的蛋白表達水平。如圖 1 所示，與親本 Lovo 細胞相比，miR-20a 在 Lovo/5-FU 細胞中高表達，ST8SIA2 的 mRNA 及蛋白均呈現(xiàn)低表達水平，表達差異具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）。

圖 1 miR-20a、ST8SIA2 在 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞中的差異表達（*P < 0.05）

Figure 1 Differential expression of miR-20a and ST8SIA2 in Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (*< 0.05)

圖 2 Lovo 及 Lovo/5-FU 細胞轉染 miR-20a 的轉染效率（A）和調控 miR-20a 的表達對結直腸癌細胞耐藥性有顯著影響（B）（*P < 0.05）

Figure 2 The transfection efficiency of miR-20a transfected with Lovo and Lovo/5-FU cells were shown (A) and regulation of miR-20a expression had a significant effect on drug resistance in colorectal cancer cells (B) (*< 0.05)

2.2 調控 miR-20a 的表達對結直腸癌細胞體外藥敏性的影響

為了驗證 miR-20a 是否參與結直腸癌耐藥，通過轉染技術，使 Lovo 中 miR-20a 表達升高，Lovo/5-FU 中 miR-20a 表達下降。RT-PCR 技術檢測其轉染效率，如圖 2A 所示，轉染前后 miR-20a 表達水平有顯著性變化（< 0.05）。CCK-8 法分析了過表達 miR-20a 的 Lovo 細胞及干擾了 miR-20a 的 Lovo/5-FU 細胞對不同濃度 5-FU 處理后的細胞生存率，結果如圖 2B 所示，過表達 miR-20a 后 Lovo 細胞對 5-FU 的敏感性下降；而干擾 miR-20a 的 Lovo/5-FU 細胞對 5-FU 的敏感性增加。

2.3 miR-20a 與 ST8SIA2 表達的相關性

采用 RT-PCR、Western blot 及免疫熒光對 ST8SIA2 的表達進行分析，圖 3A 結果顯示，Lovo 細胞過表達 miR-20a 后，ST8SIA2 的表達水平顯著下降；圖 3B 顯示 Lovo/5-FU細胞下調 miR-20a 表達后，ST8SIA2 的表達水平顯著上升（< 0.05）。

2.4 ST8SIA2 是 miR-20a 的靶基因

生物信息學分析表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潛在靶標（圖 4）。為了驗證這一結論，我們進行了雙熒光素酶報告實驗，結果顯示（圖 4），與 wt-ST8SIA2 + miR-20a control 組相比，wt-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組熒光素酶活性顯著降低（< 0.05），mu-ST8SIA2 + miR-20a mimic 組熒光素酶活性沒有變化，表明 miR-20a 可以靶向結合 ST8SIA2 的3'-UTR。

2.5 過表達 ST8SIA2 抑制 miR-20 對 Lovo 細胞藥敏性的影響

為進一步明確 miR-20a 與 ST8SIA2 對結直腸癌細胞耐藥的影響，我們對 Lovo 細胞進行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的過表達。如圖 5 所示，只有 miR-20a 過表達時與對照組比，細胞存活率增加，其耐藥性顯著增加（< 0.05）。同時過表達 miR-20a 和 ST8SIA2 時，細胞的存活率下降，其耐藥性顯著降低（< 0.05）。

3 討論

近年來，隨著基因組學、蛋白組學、糖生物學的發(fā)展，尋找抗腫瘤治療的新策略正在向miRNA 等方面發(fā)展。關于 miRNA 與結直腸癌之間的關系，已有很多報道。有研究表明，MicroRNA-182 能夠促進結直腸癌的增殖及轉移[5]。結直腸癌中，MicroRNA-26b 靶向煙酰胺磷酸核糖轉移酶，起到抑制腫瘤的作用[6]。miR-20a 可靶向 BNIP2 促進結直腸癌細胞耐藥[7]。miR-149 可增強結直腸癌細胞對 5-FU 的敏感性[8]。結直腸癌細胞中存在異常表達的miRNA 受到更多人的關注。

圖 3 Lovo 細胞過表達 miR-20a 后，ST8SIA2 的表達水平（A）和 Lovo/5-FU 細胞下調 miR-20a后，ST8SIA2 的表達水平（B）（*P < 0.05）

Figure 3 The levels of ST8SIA2 were revealed after Lovo cells overexpressed miR-20a (A) and the levels of ST8SIA2 were shown after Lovo/5-FU cells down-regulated miR-20a (B) (*< 0.05)

圖 4 miR-20a 可直接靶向結合 ST8SIA2 的 3'-UTR（*P < 0.05）

Figure 4 miR-20a could directly target the 3'-UTR of ST8SIA2 (*< 0.05)

在不同的腫瘤中，唾液酸糖基轉移酶的差異表達可作為癌癥的預后指標以及治療的潛在靶點[9]。有研究表明結直腸癌會發(fā)生糖基轉移酶表達的改變，如 ST6Gal1 在結腸癌中表達上調，并與腫瘤細胞的侵襲和轉移正相關[10]。關于 ST8SIA2 與結直腸癌的關系鮮有報道，但是有研究稱 ST8SIA2 參與肝癌侵襲和耐藥的發(fā)展[11]。因此。本文通過探討 miR-20a 及唾液酸轉移酶 ST8SIA2 參與結直腸癌耐藥的可能機制，為診斷、治療結直腸癌耐藥提供新思路。

本研究中，我們采用 Real-time PCR 技術及Western blot 技術證實 ST8SIA2 在結直腸癌耐藥細胞株中的表達顯著高于結直腸癌敏感細胞株。進一步檢測了 Lovo 細胞與 Lovo/5-FU 細胞中 miR-20a的表達量，發(fā)現(xiàn)與Lovo 細胞相比，在Lovo/5-FU 細胞中miR-20a 的表達量顯著升高。為了驗證miR-20a 與結直腸癌耐藥的關系，我們上調了 Lovo 細胞中miR-20a 的表達，發(fā)現(xiàn)上調 miR-20a 后 Lovo 細胞體外對藥物的耐藥性顯著升高。下調miR-20a 后，Lovo/5-FU 細胞對藥物耐藥性顯著降低。以上結果表明 miR-20a 參與了結直腸癌的耐藥，結直腸癌細胞對 5-FU 藥物的耐藥程度隨著 miR-20a 表達的增加而增強。我們對轉染后的細胞進行了 ST8SIA2 表達的檢測，發(fā)現(xiàn) miR-20a 與 ST8SIA2 的表達呈現(xiàn)負相關。因此，我們猜想 miR-20a 與 ST8SIA2 之間可能存在某種關聯(lián)。

圖 5 過表達 ST8SIA2 可逆轉 miR-20a 對細胞藥物敏感性的作用（*P < 0.05）

Figure 5 Over expression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a on cellular drug sensitivity (*< 0.05)

為進一步了解miR-20a 在結直腸癌耐藥中如何發(fā)揮作用，我們意圖找到 miR-20a 的潛在靶點。靶基因預測表明，ST8SIA2 是 miR-20a 的潛在靶標。我們利用雙熒光素酶報告實驗，驗證了 ST8SIA2 確實是 miR-20a 的直接靶基因。之后我們對 Lovo 細胞進行了 miR-20a 和 ST8SIA2 的過表達，結果表明，過表達 ST8SIA2 后可逆轉 miR-20a 對結直腸癌細胞的作用。本研究中，我們采用體外實驗初步探討了 miR-20a 參與結直腸癌耐藥的機制，并沒有進行體內實驗及臨床標本的進一步驗證，我們將在后續(xù)工作中進行體內的驗證及機制的深入研究。

綜上所述，miR-20a 與結直腸癌細胞耐藥的發(fā)生密切相關，并且可能是通過靶向負調控ST8SIA2 的表達進而促進結直腸癌的耐藥。明確 miR-20a 在結直腸癌耐藥中的作用機制，可為結直腸癌的治療提供新的策略。

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Effect of microRNA-20a on the colorectal cancer drug resistance by targeting ST8SIA2

GONG Xiao-hong, WANG Dan, SHEN Zong-kun, JIA Li, LIU Ling

Department of Clinical Laboratory, Dalian Traditional Chinese Medical Hospital, Liaoning 116013, China (GONG Xiao-hong); Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Anshan Iron and Steel Group Corporation, Liaoning 114002, China (WANG Dan); Department of Clinical Laboratory, Fuxin Central Hospital, Liaoning 123000, China (SHEN Zong-kun); College of Laboratory Medicine, Dalian Medical University, Liaoning 116044, China (JIA Li); Department of Clinical Laboratory, Dandong First Hospital, Liaoning 118000, China (LIU Ling)

We aim to explore the mechanism of miR-20a to regulate ST8SIA2 in colorectal cancer drug resistance and to provide a novel therapeutic strategy and target of colorectal cancer.

The expression of miR-20a and ST8SIA2 was analyzed by real-time PCR and Western blot in colorectal cancer cells. CCK-8 and Western blot assays were used to detect the drug sensitivity and the ST8SIA2 expression in the two cell lines after up-regulation and downregulation of miR-20a, respectively. The interaction between miR-20a and its predicted target gene ST8SIA2 was confirmed by 3'-UTR dual-luciferase reporter assay. The cell viability was obtained to further investigate the drug sensitivity of Lovo cells upon transfection with miR-20a mimic and ST8SIA2.

miR-20a was highly expressed and ST8SIA2 lowly expressed in Lovo/5-FU cells. Overexpression of miR-20a in Lovo cells could decrease ST8SIA2 level, and decrease the chemosensitivity to anti-tumor drugs.Silencing of miR-20a in Lovo/5-FU cells resulted in the increased expression of ST8SIA2, and increased the chemosensitivity to anti-tumor drugs. Overexpression of ST8SIA2 could reversed the effect of miR-20a mimic on drug resistance.

The levels of miR-20a and ST8SIA2 were closely related to the drug resistance in colorectal cancer. miR-20a could regulate drug resistance in colorectal cancer cells by targeting ST8SIA2 expression.

Colorectal neoplasms; miR-20a; ST8SIA2; Drug resistance, neoplasms

LIU Ling, Email: 15614328@qq.com

劉鈴，Email：15614328@qq.com

2018-09-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.006