張青嫻 ，徐引弟 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文強(qiáng) ，李海利 ，方劍玉 ，郎利敏 ，張立憲 ，游 一 ，許 峰 ，鄭萬錄 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括青霉素類、頭孢菌素類和其他β-內(nèi)酰胺類，此類抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)癥廣及臨床療效好等優(yōu)點(diǎn)。其主要作用機(jī)制是產(chǎn)生能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的黏肽合成酶（又叫青霉素結(jié)合蛋白，PBPs），從而阻礙細(xì)胞壁黏肽的合成。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs） 是腸桿菌科細(xì)菌對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的最主要機(jī)制，其中，大腸桿菌是ESBLs最主要的產(chǎn)生菌。ESBLs基因型眾多，根據(jù)質(zhì)粒編碼基因和ESBLs優(yōu)先水解底物的不同主要分為CTX-M型、TEM型、SHV型、OXA型和其他型等[1-6]。

為了解河南省豬源ESBLs大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性流行情況，本試驗(yàn)對(duì)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室2018年1—4月所分離的70株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥基因的相關(guān)檢測(cè)，采用CLSI推薦的表型篩選和確證試驗(yàn)檢測(cè)大腸桿菌攜帶ESBLs情況，用PCR方法檢測(cè)ESBLs 基 因（blaCTX-M，blaTEM，blaSHV，blaOXA）的流行分布情況，旨在為獸醫(yī)臨床ESBLs大腸桿菌耐藥性的評(píng)估與治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年1—4月，從河南省規(guī)模化豬場(chǎng)采集有腹瀉癥狀的豬肺臟、氣管等組織，通過細(xì)菌培養(yǎng)、純化和PCR檢測(cè)等方法共獲得70株大腸桿菌。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soybroth，TSB）購自 Difco公司。麥康凱（MC）瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、苗勒-欣頓（MHA）瓊脂、革蘭氏染色液等購自北京奧博星生物公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq PCR master mix，DL2000 DNA Marker等PCR試劑購自寶生物（大連）有限公司。DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ESBLs大腸桿菌耐藥表型菌株測(cè)定 參照2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and LaboratoryStandards Institute，CLSI）推薦的雙紙片法進(jìn)行[7]。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用K-B法測(cè)定ESBLs分離菌株對(duì)18種常用抗菌藥物的敏感性。所用藥敏紙片包括：阿米卡星（AK）、四環(huán)素（TE）、氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、氧氟沙星（OFX）、頭孢噻呋（EFT）、恩諾沙星（ENR）、頭孢唑林（CZ）、復(fù)方新諾明（STX）、新霉素（N）、頭孢哌酮（CFP）、氟苯尼考（FFC）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、環(huán)丙沙星（CIP）等。

1.2.3 PCR方法檢測(cè)ESBLs大腸桿菌基因型 參照GenBank已發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：CTX-M，F(xiàn) 5′-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3′，R5′-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3′；OXA，F(xiàn)5′-AT GAAAAACACAATACATATCAACTTCGC-3′，R5′-G TGTGTTTAGAATGGTGATCGCATT-3′；TEM，F(xiàn)5′-C ATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3′，R5′-CGTTCATCC ATAGTTGCCTGAC-3′；SHV，F(xiàn)5′-AGCCGCTTGAGC AAATTAAAC-3′，R5′-ATCCCGCAGATAAATCACC AC-3'；DHA，F(xiàn)5'-TGATGGCACAGCAGGATATTC-3′，R5'-GCTTTGACTCTTTCGGTATTCG-3'。

將經(jīng)ESBLs確證試驗(yàn)的30株ESBLs大腸桿菌菌株分別接種TSA平皿，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后，挑取單個(gè)菌落，置于100 μL滅菌超純水中，旋渦混勻，100℃煮沸10min后12000r/min離心10min，取上清提取DNA作為PCR模板備用。

PCR 體系為：13 μL Taq PCR master mix，1 μL上游引物，1 μ 下游引物 2，5 μL 菌液，5 μL ddH2O，進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESBLs大腸桿菌耐藥表型測(cè)定結(jié)果

70株大腸桿菌雙紙片法一共鑒定出30株ESBLs菌，其中，肺臟20株，脾臟1株，氣管5株，關(guān)節(jié)1株，有3株分離自心臟。區(qū)域分布基本覆蓋全省較多地市，無明顯地域性差異。

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果按2017年CLSI[7]的標(biāo)準(zhǔn)判斷，結(jié)果如表1、圖1和表2所示。

表1 大腸桿菌分離株的藥敏結(jié)果 mm

續(xù)表1 mm

由表1可知，30株 ESBLs菌有6株（36，45，48，67，69，70號(hào)菌株）對(duì)CAZ耐藥，并非 100%敏感，而對(duì)CTX耐藥的則有 11 株（菌株32，36，38，42，45，48，50，51，60，61，64 號(hào)），說明用 CTX檢測(cè) ESBLs菌的敏感性高于CAZ，且紙片法測(cè)定的ESBLs菌不一定對(duì)CAZ和CTX耐藥。

從圖1和表2可以看出，大腸桿菌ESBLs菌對(duì)常用藥物的耐藥率均超過70%，全部為14種耐藥以上，且17種和18種耐藥共20株，占ESBLs菌的66.7%。對(duì)常用藥物尤其是頭孢類藥物耐藥，其耐藥譜平均耐16.8種藥，要高于非ESBLs菌。ESBLs菌和非ESBLs菌耐藥率差異最大的為頭孢類藥物，即EFT，CZ，CFP，CAZ和 CTX。

表2 大腸桿菌分離株的耐藥譜

續(xù)表2

大腸桿菌非ESBLs菌耐藥譜均為7種以上，13種及以上耐藥菌株有23株，占總數(shù)的57.5%。所分離的非ESBLs菌平均耐13.1種藥，對(duì)常用18種藥物除頭孢類外，對(duì)其他氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、青霉素類、磺胺類和氯霉素類等均表現(xiàn)出高于60%的耐藥率，說明大腸桿菌的耐藥性較高，且均為多重耐藥。

2.3 大腸桿菌ESBLs耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別擴(kuò)增30株ESBLs菌的CTX-M基因、TEM基因、OXA基因、SHV基因和DHA基因，陽性基因型片段均與預(yù)期設(shè)計(jì)相符合，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2～4和表3所示。CTX-M基因型擴(kuò)增結(jié)果表明，預(yù)期條帶大小為415 bp（圖2）；TEM基因型擴(kuò)增結(jié)果表明，預(yù)期條帶大小為800 bp（圖3）；SHV基因型擴(kuò)增結(jié)果表明，預(yù)期條帶大小為713 bp（圖4）。擴(kuò)增出與預(yù)期設(shè)計(jì)相符合者為陽性，其中，陽性率分別為CTX-M53.3%，TEM66.7%，SHV3.3%，未擴(kuò)增出OXA，DHA基因。

表3 耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)

從表3可以看出，30株ESBLs菌株除3株未擴(kuò)增出ESBLs耐藥基因外，同時(shí)攜帶有CTX-M和TEM基因型的為9株，占30%，同時(shí)攜帶CTX-M和SHV基因型的有1株，其余菌株均含有1個(gè)耐藥基因，含CTX-M基因型菌株檢出率為53.3%，含TEM基因型菌株檢出率為66.7%，為本試驗(yàn)分離株的優(yōu)勢(shì)基因型。

3 討論

病料分離結(jié)果證明，來自于肺臟、脾臟、關(guān)節(jié)和氣管的ESBLs大腸桿菌藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)無明顯規(guī)律性。

藥敏試驗(yàn)證明，所分離的30株ESBLs菌對(duì)頭孢類的耐藥率并非是100%，部分菌株表現(xiàn)出對(duì)該類藥物敏感，但是ESBLs菌具有體外敏感而體內(nèi)耐藥的特點(diǎn)，故不能僅通過體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果來指導(dǎo)臨床用藥[8]。大腸桿菌ESBLs株分離率為42.8%，低于苑麗等[8]的76.7%，而高于大多數(shù)研究者的分離率[7-11]，可能說明近年來大腸桿菌ESBLs菌的分離率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，也說明頭孢類藥物在臨床上的應(yīng)用和耐藥率越來越高。而非ESBLs菌對(duì)各類抗生素的耐藥率也在60%以上，且耐藥譜13種以上的居多，說明河南省大腸桿菌的耐藥性很高，且均為多重耐藥。

我國(guó)分離的ESBLs大腸桿菌基因型主要以CTX-M型為主，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所傳染病研究室所分離的ESBLs大腸桿菌則以CTX-M型和TEM型為主，這與國(guó)內(nèi)大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致[5-6，7-12]，但未擴(kuò)增出同時(shí)存在2種以上基因型的菌株。而歐美國(guó)家以TEM型和SHV型為主，葡萄牙動(dòng)物源性ESBLs大腸桿菌基因型則以TEM-1，OXA和SHV為主；西班牙動(dòng)物源性ESBLs大腸桿菌基因型流行TEM-1，SHV-1和OXA型，不同國(guó)家和地區(qū)流行的ESBLs大腸桿菌耐藥基因不同與本地區(qū)抗生素的使用方法、種類和數(shù)量等因素有關(guān)[13-16]。

ESBLs大腸桿菌不僅含有ESBLs耐藥基因，還同時(shí)攜帶有其他耐藥基因[16-17]。BATCHELOR等[17]研究表明，介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因常常與介導(dǎo)氨基糖苷類、氯霉素類和磺胺類藥物的耐藥基因在同一質(zhì)粒上，導(dǎo)致耐藥性的共選擇（Co-selection）和共同播散，即其他藥物（如氨基糖苷類、氯霉素類或磺胺類藥物）的使用，可能會(huì)使β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性選擇出來。河南省ESBLs大腸桿菌耐藥基因以CTX-M和TEM為主，且分離率逐漸增高，說明養(yǎng)殖企業(yè)使用頭孢噻肟和頭孢他啶類藥物的頻率正在逐年增加，會(huì)導(dǎo)致今后養(yǎng)殖業(yè)用藥越來越困難。由于耐藥基因的宿主可轉(zhuǎn)移性，隨之會(huì)產(chǎn)生人類公共衛(wèi)生安全隱患，應(yīng)研制出中藥等其他替代藥物，減少第3代抗生素的大規(guī)模使用，以免給人和動(dòng)物的健康帶來重大影響[18-22]。