司新鵬

摘 要：目的 以人肺癌細胞株A549為研究對象，觀察不同濃度/時間下索拉尼非對人肺癌細胞A549的增殖及其對VEGFR-2、VEGFR-3、P-VEGFR-2及P-VEGFR-3表達的影響。方法 不同濃度的索拉非尼（1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L）分別與A549細胞體外培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后采用四甲基偶氮唑藍比色法測定細胞生長抑制率。采用RT-PCR法測定不同藥物濃度/時間下肺癌細胞株A549中VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達變化，用Western Blot法測定P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達。結果 在外源性藥物索拉非尼的刺激下，肺癌細胞A549的生長受到抑制，索拉非尼的濃度越高，作用時間越長，抑制率越大，提示呈現(xiàn)時間和濃度依賴性（P<0.05）。以終濃度為1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的索拉非尼加入實驗組，在不同的作用時間（24 h、48 h、72 h）下，實驗組與對照組比較VEGFR-2mRNA及VEGFR-3mRNA的表達無明顯變化（P>0.05）。P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達與對照組比較呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.05），呈濃度依賴性。結論 索拉非尼能抑制A549肺癌細胞的生長，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。索拉非尼能抑制A549肺癌細胞的生長，其機制之一可能與其抑制P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達有關。

關鍵詞：索拉非尼；A549肺癌細胞；VEGFR-2；VEGFR-3；P-VEGFR-2；P-VEGFR-3

中圖分類號：R734.2 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.003

文章編號：1006-1959（2018）17-0008-06

Abstract：Objective The proliferation of human lung cancer cell line A549 and its effects on the expression of VEGFR-2，VEGFR-3， P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 were observed at different concentrations/time.Methods Different concentrations of sorafenib（1.5μmol/L，3μmol/L，6μmol/L，12μmol/L）were cultured with A549 cells for 24，48 and 72h respectively.The inhibition rate of cell growth was determined by tetramethylazo blue colorimetry.The expression of VEGFR-2 mRNA and VEGFR-3 mRNA in lung cancer cell line A549 was detected by RT-PCR and the expression of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 was detected by Western Blot.Results Under the stimulation of the exogenous drug sorafenib，the growth of lung cancer cell A549 was inhibited.The higher the concentration of sorafenib， the longer the duration of action，the greater the inhibition rate， suggesting time- and concentration-dependent（P<0.05）. Sorafenib at a final concentration of 1.5μmol/L，3μmol/L，6μmol/L，and 12μmol/L was added to the experimental group at different time（24h，48h，72h），there was no significant difference in the expression of VEGFR-2 mRNA and VEGFR-3 mRNA between the experimental group and the control group（P>0.05）.The expression of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 decreased in a concentration-dependent manner compared with the control group（P<0.05）.Conclusion Sorafenib can inhibit the growth of A549 lung cancer cells in a time-and concentration-dependent manner.Sorafenib can inhibit the growth of A549 lung cancer cells，and one of its mechanisms may be related to its inhibition of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 expression.

Key words：Sorafenib；A549 lung cancer cells；VEGFR-2；VEGFR-3；P-VEGFR-2；P-VEGFR-3

隨著腫瘤分子生物學的研究進展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要作用。分子靶向治療已使眾多腫瘤患者受益，目前已有多種靶向治療藥物上市并在某些腫瘤的臨床試驗中證實有效[1]。然而，大部分腫瘤的生物學行為并非由單一信號傳導通路所支配，而是多個信號傳導通路共同起作用的，因此，針對多靶點進行靶向治療可能會取得更好的療效[2]。索拉非尼是一種小分子多靶點的生物靶向治療新藥，是首個口服多激酶抑制劑，目前已成為腫瘤學界倍受關注的抗腫瘤藥物之一[3]。大量的體外腫瘤細胞和實驗動物模型以及臨床研究都已證實，索拉非尼的療效是可喜的，使抗腫瘤從化療和免疫治療階段邁入了靶向治療的時代[4]。拜耳和Onyx藥業(yè)公司從腫瘤的發(fā)生機理和腫瘤生長需要新生血管提供營養(yǎng)入手，聯(lián)合研制了索拉非尼（sorafenib）。索拉非尼能作用于多個靶點，對多種腫瘤細胞有抑制作用。索拉非尼既能直接抑制腫瘤細胞的增殖，又能通過抑制血管新生，達到腫瘤饑餓療法的目的[5]。2005年12月20日獲美國FDA快速批準了其作為晚期腎細胞癌的一線治療藥物，是美國FDA10年來批準的第一個治療腎癌的藥物。目前研究表明，索拉非尼對肝癌、非小細胞肺癌以及黑色素瘤等也有療效[6]。本研究以人肺癌細胞株A549為研究對象，觀察不同濃度/時間下索拉尼非對人肺癌細胞A549的增殖及其對VEGFR-2、VEGFR-3、P-VEGFR-2及P-VEGFR-3表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑 肺腺癌細胞A549，泰安市中心醫(yī)院；小牛血清；RPMI1640粉劑；胰蛋白酶；索拉非尼；P-VEGFR-2多克隆抗體（兔抗人）；P-VEGFR-3多克隆抗體（兔抗人）；堿性磷酸酶標記的二抗（抗兔）。

1.2主要設備 倒置顯微鏡 IX70，Olympus；細胞培養(yǎng)箱（311型）；電子天平；超凈工作臺 SW-CJ-1F；60 mm培養(yǎng)皿；低溫超速離心機；立時壓力蒸汽滅菌器；紫外分光光度計；垂直平板；電泳槽、轉移電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、半干電轉移儀；GDS 8000型凝膠成像分析系統(tǒng)；氣浴恒溫振蕩器；DDY-2C型電泳儀；電熱恒溫水溫箱；加樣槍（1000 μl、100 μl和0.5～10 μl）Eppendorf，德國；烘干箱。

1.3細胞培養(yǎng) 將取出的凍存管直接投入37 ℃溫水中，并輕輕搖動令其盡量融化。從37 ℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上體積的培養(yǎng)液，混合后低速離心800 rpm，5 min。除去上清液，再重復用培養(yǎng)液洗一次。用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4細胞給藥 取第4代肺癌細胞，待細胞生長覆蓋瓶底80%，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于96、6孔無菌培養(yǎng)板，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度下。至細胞單層鋪滿孔底，按下述分組給藥：①正常對照組，不加任何藥物。②以終濃度為1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的濃度梯度加入各組。四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測細胞的增殖抑制率，用RT-PCR檢測VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達，用Western blot檢測P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達。

1.5輸入計算機系統(tǒng)對蛋白質(zhì)條帶進行密度分析 將Western Blot曝光膠片進行圖像掃描，用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化，目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。為消除掃描和分析中的誤差，重復三次該過程，并取均值作統(tǒng)計學分析。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析結果，所有實驗數(shù)據(jù)均重復3次，結果以（x±s）表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1索拉非尼抑制細胞增殖試驗 索拉非尼作用于A549肺癌細胞的抑制率在同一時間點、不同濃度組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），同一濃度組不同時間點比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。MTT結果顯示：隨著藥物濃度的增大，藥物作用時間的延長，索拉非尼對肺癌細胞A549生長的抑制率越大。說明索拉非尼能抑制肺癌細胞A549的生長，呈現(xiàn)一定的劑量-時間依賴關系（P<0.05）。

2.2索拉非尼對P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達的影響

2.2.1索拉非尼對P-VEGFR-2表達的影響 采用半定量Western Blot方法，應用Quantity one v4.62生物圖像處理軟件測定對Western-Bolt圖片進行分析，結果與β-action的相對光密度比值表示。結果顯示：索拉作尼作用于肺癌細胞A549 24 h、48 h、72 h后，P-VEGFR-2的表達水平與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同一時間點組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同一濃度不同時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。說明不同濃度的索拉非尼對A549肺癌細胞P-VEGFR-2的表達有抑制作用：索拉非尼濃度越高，抑制作用越強，提示呈濃度依賴性。

2.2.2索拉非尼對P-VEGFR-3表達的影響 采用半定量Western Blot方法，應用Quantity one v4.62生物圖像處理軟件測定對Western-Bolt圖片進行分析，結果與β-action的相對光密度比值表示。結果顯示：索拉作尼作用于肺癌細胞A549 24 h、48 h、72 h后，P-VEGFR-3的表達水平與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同一時間點組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同一濃度不同時間段比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。說明不同濃度的索拉非尼對A549肺癌細胞P-VEGFR-3的表達有抑制作用：索拉非尼濃度越高，抑制作用越強，提示呈濃度依賴性。

2.3索拉非尼對VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA表達的影響

2.3.1索拉非尼對VEGFR-2mRNA表達的影響 加入藥物索拉非尼作用24 h、48 h、72 h后，肺癌細胞A549 VEGFR-2mRNA/GAPDH PCR擴增產(chǎn)物的相對比值，同一時間不同濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），同一濃度不同時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4。

2.3.2索拉非尼對VEGFR-3mRNA表達的影響 加入藥物索拉非尼24 h、48 h、72 h后，肺癌細胞A549 VEGFR-3mRNA/GAPDH PCR擴增產(chǎn)物的相對比值，同一時間不同濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），同一濃度不同時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表5。

3討論

索拉非尼是拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點的生物靶向新藥，目前索拉非尼用于肝癌治療的3期臨床試驗已完成患者入組，正在進行中。此外，2006年11月30日索拉非尼在中國上市。索拉非尼對黑色素瘤、非小細胞肺癌等實體瘤亦有潛在的抗腫瘤效應，其用于轉移性黑素瘤、皮膚癌、非小細胞肺癌的臨床試驗亦在進行中。目前對于索拉非尼的研究尚處于起步階段。

為了準確的檢測不同濃度/時間下索拉非尼對人肺癌細胞A549的體外抑制作用，本實驗采用MTT比色法對加入藥物后的肺癌細胞A549活性進行檢測。MTT比色法的特點是簡單、快捷、準確，廣泛用于細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等[6]。

本實驗結果顯示：不同濃度/時間下索拉非尼對人肺癌細胞A549的抑制率不同。在同一時間點，各濃度組細胞抑制率較陰性對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并隨著藥物濃度的增加，其抑制效果越明顯，各濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示當作用時間相同時，索拉非尼的濃度越大，對肺癌細胞A549的抑制率就越大。同一濃度組不同時間點進行比較，抑制率較陰性對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。并隨著藥物作用時間的延長，其抑制效果越明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示藥物濃度相同時，作用時間越長，抑制率就越大。索拉非尼能夠抑制肺癌細胞A549的生長；隨著索拉非尼濃度越大，作用時間越長，抑制率就越大，呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

索拉非尼具有雙重抗腫瘤作用，它可以通過抑制上述RAF/MEK/ERK信號傳導通路直接抑制腫瘤生長。RAS/RAF/MEK/ERK信號傳導通路是細胞周期調(diào)控、基因表達、細胞增殖和分化過程中的主要途徑，而RAF為該通路中的關鍵激酶，它有3個同工酶，分別為A-RAF、B-RAF與C-RAF，它們均與細胞增殖、分化及血管生成的調(diào)節(jié)密切相關。大部分刺激細胞生長的因子，包括EGF、PDGF、VEGF和c-KIT，與細胞表面的受體結合后，即可通過受體酪氨酸激酶自體磷酸化的方式首先激活RAS，RAS又進一步激活RAF/MEK/ERK信號傳導通路，將生長因子的信號帶入細胞核，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉錄和促進細胞增殖的作用。生長因子受體酪氨酸激酶活性的增加、RAS基因突變和過度表達以及RAF基因突變都可導致信號傳導通路的過度激活，從而引起細胞的過度增殖。已知在人類腫瘤細胞中A-RAF和C-RAF突變非常少見，B-RAF突變占7%，RAS基因突變占15%～30%。30%卵巢癌、35%～53%甲狀腺癌、30%結腸癌以及50%～70%惡性黑色素瘤中有B-RAF基因突變。索拉非尼正是通過抑制RAF活性從而阻斷了RAF/MEK/ERK信號傳導通路，抑制腫瘤細胞的增殖，直接抑制腫瘤生長。

索拉非尼還可以通過抑制幾種與血管生成和腫瘤發(fā)展有關的酪氨酸激酶受體的活性，包括血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2），VEGFR-3，血小板衍生的生長因子受體-β（PDGFR-β）和c-KIT原癌基因，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細胞的生長，從而起到抗腫瘤作用。VEGF刺激VEGFR-2、VEGFR-3，介導腫瘤血管內(nèi)皮細胞DNA合成和增殖。其信號轉導主要是通過ERK通路，使VEGFR-2及VEGFR-3酪氨酸磷酸化，通過中間一些未知機制激活ERK級聯(lián)反應，進而引起血管內(nèi)皮細胞增殖，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)引起腫瘤生長。

通過目前對VEGF/VEGFR信號通路作用機制的了解，可以得到以下幾種可能的抑制劑研究方向：①利用單克隆抗體抑制VEGF或VEGFR，使其不能特異性結合，阻斷信號傳導，也可以利用基因技術抑制它們的表達，減弱其活性。②設計特定的小分子抑制劑，結合到VEGFR胞外VEGF結合區(qū)域，競爭性拮抗VEGF，同理，也可以是結合到VEGF上VEGFR的特定結合域，競爭性拮抗VEGFR。③抑制VEGFR的胞內(nèi)激酶域，主要是ATP的結合位點，競爭性地拮抗ATP，使其無法提供γ磷酸基。④抑制胞內(nèi)的VEGFR下游信號的關鍵性蛋白。

本實驗采用RT-PCR檢測VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達。它是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。

本實驗結果顯示：當藥物作用24、48、72 h后，同一濃度不同時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），同一時間不同濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示當用索拉非尼處理后，總的VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達并沒有發(fā)生變化。說明索拉非尼的多靶點抗腫瘤作用并不是直接通過VEGFR-2、VEGFR-3起作用。國內(nèi)在這方面的報道甚少。國外學者采用Western Blot檢測索拉非尼對VEGFR-2mRNA的表達影響，結果顯示，總的VEGFR-2mRNA的表達沒有發(fā)生變化。本實驗研究結果和國外文獻結果一致[7]。另外，本實驗研究了索拉非尼對VEGFR-3mRNA表達的影響，結果顯示，總的VEGFR-3mRNA的表達也沒有發(fā)生變化。

國外學者研究索拉非尼抑制VEGFR-2的自身磷酸化在兩種細胞系中被觀察到，分別是HUVECs和NIH 3T3細胞系，在HUVECs的實驗中，血管內(nèi)皮生長因子強烈誘導著受體VEGFR-2自身磷酸化，但是這一點被索拉非尼阻滯。在100 nmol/L的索拉非尼時，50%的受體VEGFR-2被抑制。同樣的在NIH 3T3的試驗中，觀察到同樣的現(xiàn)象[8，9]。這些研究結果表明，索拉菲尼是一種VEGFR-2在細胞內(nèi)的信號傳導的抑制劑。

Western Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡，它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。

本實驗顯示：當同一時間點不同濃度比較時，各濃度組細胞P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達有明顯的差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。索拉非尼的濃度越大，P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達越少，提示呈現(xiàn)濃度依賴性。提示索拉非尼能夠抑制P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達。關于索拉非尼對肺癌細胞株A549中P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達的影響，國外有文獻報道：在同一時間點不同濃度組索拉非尼能夠抑制肺癌細胞株A549中P-VEGFR-2的表達，并呈濃度依賴性[7]。與本實驗觀察到的結果一致。同時，本實驗結果還發(fā)現(xiàn)索拉非尼能夠抑制人肺癌細胞株A549中P-VEGFR-3的表達，同樣呈濃度依賴性。

另外本實驗顯示：在同一濃度組不同時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），這與MTT的結果（索拉非尼能夠抑制人肺癌細胞A549的生長，呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性）不一致。說明索拉非尼對于人肺癌細胞A549可能還存在著其它的靶點。

總之，索拉非尼能夠抑制人肺癌細胞A549的生長，其機制并不是通過直接抑制VEGFR-2和VEGFR-3的表達，而是可能通過抑制信號轉導通路上游分子VEGFR-2和VEGFR-3的磷酸化水平，以阻止腫瘤血管生成，從而起到抗腫瘤作用，這就為索拉非尼用于肺癌提供了理論依據(jù)。

本實驗是體外實驗，腫瘤細胞脫離體內(nèi)生長內(nèi)環(huán)境會受外界多種因素影響；藥物在體內(nèi)作用比在體外實驗中要復雜，索拉非尼在不同藥物濃度/時間下對體外細胞毒作用只是體內(nèi)殺傷作用的相對反映，而且受實驗條件限制，結果有一定局限性；另外本實驗選取單一肺癌細胞、單一藥物索拉非尼，對于此實驗還有繼續(xù)探討的空間。因此，關于索拉非尼對肺癌的作用機制，我們還要大量體內(nèi)外實驗繼續(xù)深入的研究以便為臨床應用提供充足的理論依據(jù)。

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收稿日期：2018-6-7；修回日期：2018-6-22

編輯/楊倩