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諾如病毒是引起人類非細菌急性胃腸炎的首要病原體[1]。全世界范圍內(nèi)約1/5的腹瀉病例與諾如病毒感染相關(guān)，每年約導致20萬人死亡[2]。諾如病毒進化變異速度快，每隔2～3年會出現(xiàn)新的流行株引發(fā)大流行，其機制[3]主要是：①諾如病毒衣殼蛋白區(qū)氨基酸發(fā)生突變，其中P區(qū)處于高度變異，被認為是免疫識別和與人體組織血型抗原(HBGA)結(jié)合的關(guān)鍵部位[4]；②基因重組。在過去二十年間諾如病毒GII.4型一直為優(yōu)勢流行株[5]，直至2014-2015冬季在多個亞洲地區(qū)國家新型GII.P17-GII.17型基因型取代GII.4_Sydney_2012型成為優(yōu)勢流行株[6]；但中國CDC報道自2016下半年以來新重組基因型GII.P16-GII.2在諾如病毒暴發(fā)病例中檢出率超過GII.P17-GII.17及GII.4型，成為我國引起急性胃腸炎暴發(fā)的優(yōu)勢基因型[7]。本文收集舟山海島地區(qū)2017年5-11月4起學校發(fā)生的急性胃腸炎暴發(fā)疫情病例樣本，通過擴增其聚合酶-衣殼區(qū)(B-C區(qū))，近乎完整的聚合酶區(qū)(RdRp)及衣殼蛋白區(qū)(VP1)基因序列，鑒定引起本輪諾如病毒暴發(fā)疫情的基因型別及分子特征，為諾如病毒的防控提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來源及處理 2017年5-11月，舟山市定海區(qū)兩所幼兒園、一所小學及普陀區(qū)一所小學共發(fā)生4起急性胃腸炎暴發(fā)事件，疫情所在的縣區(qū)疾控共送檢40例樣本，其中肛拭子21份、嘔吐物13份、糞便6份；對固體樣本取豌豆大小 (液體取100 μL) 加到1.5 mL EP管中，加入900 μL的pH 7.2的PBS (10 mmol/L) 緩沖液，振蕩1 min。然后靜置5 min，再以10 000 r / min離心3 min，然后吸取200 μL上清液，使用QIAGEN Reansy Mini Kit試劑盒按照說明書提取病毒核酸。

1.2諾如病毒篩查 使用TAKARA公司One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒用于GI型和GII型諾如病毒篩查。其中GI型反應(yīng)體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV1F/JJV1R/JJV1P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL；GII型反應(yīng)體系25 μL，包括20 μmol/L的JJV2F/JJV2R/JJV2P各0.5 μL，2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5 U/μL EX Taq HS 0.5 μL，RT Ezyme Mix II 0.5 μL，雙蒸餾水5 μL，RNA 5 μL，引物探針序列見表1。反應(yīng)在ABI公司ViiA-7上進行，實驗條件設(shè)置如下：42 ℃ 10 min反轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 15 min預變性，45個循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，Ct值≤40判定為陽性。

1.3聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴增及測序 將諾如病毒陽性的樣本，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒擴增GII型聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)(557 bp)進行分型，反應(yīng)體系25 μL,包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L MON431/G2SKR各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；實驗條件設(shè)置如下：42 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 15 min預變性；40個循環(huán)95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min延伸。取10 μL擴增產(chǎn)物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。陽性擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.4聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)擴增及測序 經(jīng)分型后證實本輪暴發(fā)疫情均由諾如病毒GII.P16-GII.2所引起，隨機選擇其中1份陽性樣本使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit 試劑盒擴增近乎完整的RdRp區(qū)(1 153 bp)及VP1(1 580 bp)，其中擴增RdRp區(qū)反應(yīng)體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1 μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L RdRp-3875F/RdRp-5259R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL；擴增VP1區(qū)反應(yīng)體系25 μL，包括5xRT-PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L dNTP mix 1 μL，RT-PCR Enzyme mix 1μL，20 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，50 μmol/L VP1-5025F/VP1-6731R各0.5 μL，雙蒸餾水11 μL，RNA 5 μL。實驗條件設(shè)置如下：42 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄；95 ℃ 15 min預變性；35個循環(huán)95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；72 ℃ 7 min延伸。取10 μL擴增產(chǎn)物進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。陽性擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5基因型別鑒定及序列分析 使用MEGA 6.06 Clustal W將擴增的序列進行比對，并采用Neighbor Joining構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用Simplot軟件分析毒株的重組位點，采用200 bp的滑動窗口，20 bp的滑動步伐。使用BioEdit v.7.0.1軟件對序列編輯，同源性分析，并將RdRp區(qū)及VP1堿基序列翻譯氨基酸序列與代表株進行序列比對；同時通過諾如病毒在線分型工具(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)鑒定其型別，并與由系進化分析判定的型別進行比較，本文使用的參考序列均來源于NCBI。

表1 諾如病毒分子檢測所用引物與探針序列Tab.1 Primer and probe sequence used in molecular detection for norovirus

注：*1-6引物/探針用于 real-time PCR，7-12用于常規(guī)RT-PCR

2 結(jié) 果

2.1流行概況 2017年5-11月舟山市海島地區(qū)定海區(qū)兩所幼兒園與一所小學、普陀區(qū)一所小學分別發(fā)生急性胃腸炎暴發(fā)疫情，總病例數(shù)69例，暴發(fā)流行時間最短4 d，最長10 d；疫情呈明顯聚集性多發(fā)生于同一宿舍、班級及相鄰班級。病例年齡組在3～10歲，臨床表現(xiàn)以惡心、嘔吐為主伴隨不同程度發(fā)熱、腹瀉、腹痛，無重癥病例及死亡病例。結(jié)合流行病學調(diào)查及實驗室檢測結(jié)果判定該起疫情排除水源性和食源性傳播的可能性，認為是由諾如病毒感染引起的人傳人暴發(fā)事件。

2.2諾如病毒篩查結(jié)果 對送檢的40份樣本進行諾如病毒GI型和GII型熒光定量檢測，其中陽性樣本27例，均為諾如病毒GII型，陽性檢出率67.50%，見表2。

2.3聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴增結(jié)果及序列分析 聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，27份樣本均在557 bp出現(xiàn)特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進行序列測定，均測序成功，經(jīng)諾如病毒在線分型工具判定均為GII.P16-GII.2型，見表2。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示GII.P16-GII.2型27份，與在線分型工具所得結(jié)果一致，各個毒株間序列高度同源，相似性為98.8%～100%，見圖1。

表2 4起暴發(fā)疫情諾如病毒分子檢測結(jié)果Tab.2 The molecular detection results of norovirus in four acute gastroenteritis outbreaks

2.4聚合酶及衣殼蛋白區(qū)擴增結(jié)果及序列分析 聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，均出現(xiàn)特異性條帶。送至上海生工生物工程公司進行序列測定，測序成功后經(jīng)諾如病毒在線分型工具判定為GII.P16與GII.2型。將所得序列提交至NCBI，獲得序列號：MH057762。Simplot軟件重組分析顯示，重組位點位于ORF1-ORF2連接區(qū)處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，見圖2。 經(jīng)系統(tǒng)進化結(jié)果可見，2016-2017年新重組型GII.P16型及GII.2型均來源于2010-2012年日本的GII.P16-GII.2毒株，本次舟山海島地區(qū)幼兒園中流行暴發(fā)的GII.P16型隸屬于GII.P16c簇與2016江蘇的毒株同源性最高，為99.7%，GII.2型隸屬于GII.2c簇與2016年北京的毒株同源性最高，為99.9%，見圖3,4。將本次分離出來的新重組毒株GIIP.16-GII.2與代表株進行RdRp區(qū)及VP1區(qū)氨基酸序列比對，均發(fā)現(xiàn)多個位點發(fā)生突變，在RdRp區(qū)D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點的突變僅發(fā)生在2016-2017年重組株的GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區(qū)氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區(qū)均有多個位點突變，在潛在抗原表位及與人體HBGA結(jié)合的位點周圍共12個氨基酸位點發(fā)生突變，2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性突變。見表3，4。

注:諾如病毒命名規(guī)則按諾如病毒/基因型/宿主/國家/年份/基因亞型/分離地點/序號[8]圖1 27株諾如病毒聚合酶區(qū)-衣殼區(qū)序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果Fig.1 Phylogenetic analysis on partial RdRp and capsid protein sequences of 27 norovirus strains in Zhoushan Islands,2017

圖2 Simplot分析2017年舟山海島GII.P16-GII.2重組位點結(jié)果Fig.2 The recombination breakpoint result of GII.P16-GII.2,Zhoushan Islands,2017

圖3 GII.P16型RNA聚合酶區(qū)序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic analysis results of GII.P16 RdRp sequences

圖4 GII.2型VP1區(qū)序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic analysis results of GII.2 VP1 sequence

表3 舟山市海島地區(qū)GII.P16型諾如病毒RdRp區(qū)氨基酸序列變異結(jié)果Tab.3 The amino acid sequence mutation of GII.P16 RdRp region in Zhoushan Islands

表4 舟山市海島地區(qū)GII.2型諾如病毒衣殼蛋白區(qū)氨基酸序列變異結(jié)果Tab.4 The amino acid sequence mutation of GII.2 VP1 region in Zhoushan Islands

注：(1)由GII.4型提示可能潛在的諾如病毒A抗原表位位點(294,296-298,368,372)[9]
(2)GII.2與人體HBGA受體結(jié)合的3個位點[10]

3 討 論

諾如病毒為杯狀病毒科諾如病毒屬，為單鏈正股RNA病毒，全長約7.5-7.7 kb，整個基因組可分為ORF1、ORF2、ORF3三個開放讀碼框(ORFs),分別編碼包含RNA聚合酶(RdRp)的非結(jié)構(gòu)蛋白，主要衣殼蛋白(VP1)及次要衣殼蛋白(VP2)[11]?；赗dRp區(qū)和VP1基因序列的差異可將諾如病毒分為GI-GVII 7個基因群，GI，GII，GIV可感染人類[12]。2017年5-11月舟山市海島地區(qū)發(fā)生4起由諾如病毒GII.P16-GII.2型引起的急性胃腸炎暴發(fā)疫情，且都發(fā)生在低年齡人群學校場所。中國CDC一篇文獻報道，2016年我國大陸由諾如病毒引起的急性胃腸炎暴發(fā)中新重組的GII.P16-GII.2型檢出率為79%[7]；同期我國香港及臺灣、德國、日本、法國等報道自2016年以來GII.P16-GII.2型諾如病毒引起的暴發(fā)疫情顯著增加，且與本區(qū)域類似，大多數(shù)暴發(fā)疫情是發(fā)生在幼托，幼兒園，小學等場所[13-17]；吳冰珊等認為GII.P16-GII.2型類似于GII.4型，具有在局部人群的傳播能力[18]；但GII.4型多暴發(fā)于養(yǎng)老院等長期的健康護理機構(gòu)[19]；傳播方式傾向于人與人接觸傳播[20]，GII.P16-GII.2傳播模式是否類似于GII.4型還需進一步驗證；本次舟山海島地區(qū)分離出來的毒株GII.P16，GII.2分別與同處沿海地區(qū)江蘇省，北京市2016年報道的GII.P16及GII.2型毒株同源性最高，此前有文獻報道，對1999-2011年我國的諾如病毒重組株分析，多數(shù)型別均分布在沿海地區(qū)，且推斷受諾如病毒污染海產(chǎn)品的廣泛銷售有助于諾如病毒基因型的傳播與分布[21]。

舟山海島地區(qū)分離出來的GII.P16-GII.2型毒株，擴增近乎完整的RdRp區(qū)及VP1區(qū)，通過與代表株序列比對，在RdRp區(qū)D173E、S293T、V332I、K357Q及T360A位點的突變僅發(fā)生在2016-2017年重組株GII.P16c簇中；與GII.2代表株VP1區(qū)氨基酸序列相比，GII.2 a,b,c 三簇在P區(qū)均有多個位點突變，但在2016-2017年的GII.2c簇中并不存在特異性位點突變。在GII.4型及GII.P17型的進化過程中，P區(qū)氨基酸的變異往往對新流行株的出現(xiàn)，及其抗原性的轉(zhuǎn)變與易感人群范圍的擴大有關(guān)鍵性的作用，使得新流行株能夠逃避人群免疫力而引起廣泛的流行[22-23]，而本次新重組GII.P16-GII.2型VP1區(qū)序列分析結(jié)果提示P區(qū)位點的變異并不是促使本輪新重組株GII.P16-GII.2暴發(fā)流行的關(guān)鍵因素；采用Simplot軟件對本次分離的毒株的重組位點進行分析，結(jié)果顯示重組位點位于ORF1/ORF2連接處1 120-1 122 bp(AY134748,5 052-5 053 bp)，該區(qū)域為諾如病毒發(fā)生基因重組的主要區(qū)域[24]，基因重組是諾如病毒的進化重要機制之一，往往發(fā)生于不同亞型的混合感染病例中，衣殼蛋白區(qū)結(jié)合不同的聚合酶區(qū)，能夠改變病毒的復制與傳播能力，或者產(chǎn)生新的諾如病毒亞型，造成抗原性漂變，從而能夠逃避人群免疫力，引發(fā)大范圍的暴發(fā)流行[25]。值得注意的是近年GII.P16的重組株不斷被發(fā)現(xiàn)，表明GII.P16型RdRp區(qū)已進化具備結(jié)合多種型別衣殼蛋白區(qū)的能力，對最近出現(xiàn)的重組株GII.P16-GII.2及GII.P16-GII.4_Sydney2012型RdRp區(qū)分析發(fā)現(xiàn)有5個氨基酸位點特異性突變，并且此5個位點靠近RdRp功能區(qū)[26]，有學者推測GII.P16型RdRp區(qū)這些位點的突變改變了新重組型病毒的傳播能力，從而使其能夠廣泛的流行[27]；由于目前對于GII.P16-GII.2認識尚還不全面，這些氨基酸位點突變對于GII.P16-GII.2型的流行的貢獻還待進一步確認。

舟山市海島地區(qū)在本輪暴發(fā)疫情中首次檢測到了諾如病毒新重組型GII.P16-GII.2，提示在今后的監(jiān)測工作中開展諾如病毒的RdRp及VP1區(qū)序列檢測、監(jiān)控本區(qū)域內(nèi)諾如病毒重組情況及特殊氨基酸位點的改變，以期及時識別新出現(xiàn)的變異株，同時加強監(jiān)測力度，明確該重組型別流行特征、趨勢及是否存在特異性臨床特征及易感人群的改變，為本區(qū)域諾如病毒的防控提供科學的依據(jù)。