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腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)是引起流行性腦脊髓膜炎(簡(jiǎn)稱流腦)的病原體，分為12個(gè)血清群，其中A、B、C、W135和Y群引起了95%以上的流腦病例[1-2]。上世紀(jì)50年代至80年代末，我國(guó)發(fā)生過(guò)3次流腦全國(guó)大流行，均是由A群引起，B群和C群只引起散發(fā)病例。80年代末由于A群流腦疫苗的使用，我國(guó)流腦發(fā)病率顯著下降。2003年在安徽省發(fā)生由ST-4821序列型C群菌株引起的流腦流行[3]，之后在全國(guó)20多個(gè)省份均出現(xiàn)了ST-4821型C群菌株引起的流腦病例[4]，江西省也發(fā)生多起C群流腦暴發(fā)事件和多個(gè)散發(fā)病例[5]。2005年，全國(guó)常規(guī)免疫的流腦疫苗由A群疫苗改為A+C群疫苗。

本研究擬采用血清分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)技術(shù)，對(duì)江西省2005-2015年分離的腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行分析，旨在探討人群普遍接種A+C群流腦疫苗之后，江西省腦膜炎奈瑟菌的血清型和分子型別變化特征，了解江西省腦膜炎奈瑟菌的菌群變遷情況，為流腦的預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 200株腦膜炎奈瑟菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的于2005-2015年在江西省分離的菌株，其中臨床病人分離株15株、密切接觸者分離株57株、健康人群分離株128株。菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2試劑及儀器 血平板或巧克力平板(廣州迪景公司，中國(guó))，API NH生化鑒定試劑盒(梅里埃公司，法國(guó))，診斷血清(BD公司，美國(guó))，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))。腦膜炎奈瑟菌MLST分型引物由大連寶生物公司合成。PCR擴(kuò)增儀為PTC200(M J 公司，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)為GEL Doc2000(Bio-Rad公司，美國(guó))。

表1 本研究分析的200株腦膜炎奈瑟菌分離時(shí)間和來(lái)源分布Tab.1 Isolation time and source distribution of 200 N.meningitidis strains analyzed in the study

1.3 方法

1.3.1凍干菌株的復(fù)蘇和復(fù)核 所有腦膜炎奈瑟菌經(jīng)過(guò)常規(guī)培養(yǎng)、涂片、生化、血清鑒定后凍干保存于-20 ℃。用營(yíng)養(yǎng)肉湯溶解復(fù)蘇菌株后接種于血平板或巧克力平板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)18～24 h，挑單個(gè)菌落純培養(yǎng)后，再按常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)核鑒定。

1.3.2細(xì)菌基因組DNA的提取 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，提取的基因組DNA放-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.3PFGE實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析 參考之前的方法[3]， 主要參數(shù)是：用bioMérieux DENSIMAT比濁儀調(diào)整細(xì)菌懸液濁度為3.8-4.0；使用NheI作為限制性內(nèi)切酶；在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories，美國(guó))電泳儀中進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳；電泳參數(shù)為1～25 s，16 h。PFGE圖像錄入BioNumerics(Version5.1，Applied maths，Inc.)軟件包進(jìn)行處理和分析。圖像之間的相似性系數(shù)用Dice系數(shù)(Dice coefficients，SD)表示[6]。出現(xiàn)不同條帶即判定為不同的型別，對(duì)每一個(gè)型別都進(jìn)行命名。根據(jù)每2個(gè)圖像之間的相似性系數(shù)，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹(shù)。聚類分析時(shí)，條帶位置差異容許度設(shè)置為1.5%。

1.3.4MLST 參照PubMLST(http:/pubmlst.org/neisseria)公布的標(biāo)準(zhǔn)方案，確定進(jìn)行腦膜炎奈瑟菌 MLST的7個(gè)管家基因位點(diǎn)(abcZ、adk、aroE、fumC、gdh、pdhC、pgm)及引物。50 μL PCR反應(yīng)體系；電泳參數(shù)為：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；64 ℃，1 min；72 ℃，1 min；33個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/pubmlst.org/neisseria)進(jìn)行比對(duì)，獲得各看家基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型(ST)。

2 結(jié) 果

2.1血清型分布特征 200株腦膜炎奈瑟菌中，有168株可用現(xiàn)有血清鑒定出血清群，為C群101株，B群50株，A群12株，W135群2株，Y群2株，X群1株。另外32株用現(xiàn)有血清無(wú)法鑒定出血清群，判定為不可分群菌株。

15株臨床病人分離株均為C群。57株密切接觸者分離株中，有49株(86.0%)為C群，4株為A群，3株為B群，1株不可分群。128株健康人群菌株有37株(28.9%)為C群，8株為A群，47株為B群，2株為W135群，2株為Y群，1株為X群，31株為不可分群菌株。W135群、X群、Y群菌株只在健康人群中分離到。臨床病人和密切接觸者中的C群菌株構(gòu)成比高于健康人群(圖1)。2005年、2007年、2008年、2012年分離的健康人群菌株相比其他年份較多，結(jié)果顯示這4年的健康人群分離株的血清群構(gòu)成情況差異較大，其中2005年和2012年以B群和不可分群菌株為主，C群菌株分別只占1.9%和0%；而2007年和2008年的健康人群菌株中C群占的比例比較大，分別為58.8%和81.5%(圖2)。

圖2 不同來(lái)源腦膜炎奈瑟菌的血清型分布Fig.2 Serogroup distribution of N.meningitidis isolated in different sources

圖1 200株腦膜炎奈瑟菌按照不同來(lái)源和不同年份的血清群分布Fig.1 Serogroup distribution of N.meningitidis isolated in different sources and years

2.2C群菌株分子分型結(jié)果 我們對(duì)101株C群菌株進(jìn)行PFGE實(shí)驗(yàn)，其中6株發(fā)生染色體降解未能獲得可用的電泳圖譜。另外95株分為14個(gè)PFGE型，分別命名為NMNh.JX0001- NMNh.JX0014型。其中NMNh.JX0001和NMNh.JX0002為優(yōu)勢(shì)帶型，分別包含46和30株菌。NMNh.JX0001和NMNh.JX0002只存在1條條帶的差異。有4個(gè)帶型與優(yōu)勢(shì)帶型只相差1～3條帶，相似度大于85%，并且在聚類樹(shù)上聚集成簇(圖3中的簇1)。簇1由6個(gè)型別聚集而成，一共包含86株菌，占總菌株的90.5%(86/95)。其余8個(gè)帶型分別只包含1-2株菌，與優(yōu)勢(shì)型別差異條帶數(shù)多于9條，相似度低于65%。

圖3 對(duì)95株C群腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行PFGE分型獲得的14種帶型的聚類圖Fig.3 Cluster of 14 PFGE patterns obtained from 95 serogroup C Neisseria meningitidis

15株臨床病人分離的C群菌株分為5種型別，其中5株屬于NMNh.JX0001型，7株屬于NMNh.JX0002型。49株密切接觸者分離的C群菌株分為7種型別，其中34株屬于NMNh.JX0001型，7株屬于NMNh.JX0002型。31株健康人群C群菌株分為7種型別，其中7株屬于NMNh.JX0001型、16株屬于NMNh.JX0002型。

兩個(gè)優(yōu)勢(shì)型別(NMNh.JX0001和NMNh.JX0002)主要分布在2005-2008年以及2013-2014年(圖4)。NMNh.JX0001型菌株在2005-2006年、2007-2008年、2013-2014年3個(gè)時(shí)間段在C群菌株中所占比例分別為97.2%、28.6%、10.0%；而NMNh.JX0002型菌株在2005-2006年、2007-2008年、2013-2014年3個(gè)時(shí)間段在C群菌株中所占比例分別為2.8%、57.1%、90.0%。

圖4 C群腦膜炎奈瑟菌聚類簇中6種帶型的年份分布Fig.4 The year distribution of 6 PFGE patterns of serogroup C Neisseria meningitidis

挑選優(yōu)勢(shì)帶型以及相似帶型的33株菌株進(jìn)行MLST分型，包括16株NMNh.JX0001型、9株NMNh.JX0002型、4株NMNh.JX0003型、1株NMNh.JX0004型、2株NMNh.JX0005型、1株NMNh.JX0006型菌株。結(jié)果顯示所有33株菌均為ST-4821型。

3 討 論

我國(guó)歷史上曾發(fā)生過(guò)3次流腦全國(guó)大流行，均是由A群引起。自80年代末開(kāi)始使用A群流腦疫苗后，我國(guó)流腦發(fā)病率顯著下降，目前已經(jīng)少有A群流腦病例報(bào)道。在本研究中，江西省2005-2015年從臨床病人分離的15株腦膜炎奈瑟菌均為C群，提示江西省流腦病例目前以C群為主。本研究健康人群分離的腦膜炎奈瑟菌中，不同年份的C群菌株占比例差異很大。2005年健康人群分離的菌株中，C群只占1.9%，但是臨床病人和密切接觸者分離株幾乎全部為C群。密切接觸者均未出現(xiàn)臨床癥狀，處于健康帶菌狀態(tài)，大部分密切接觸者分離株的分子型別和病人菌株的分子型別一樣，提示密切接觸者帶有致病克隆群，可能是傳染源也可能是被病例傳染的。與江西省相鄰的安徽省在2004年發(fā)生ST-4821型C群流腦暴發(fā)流行。雖然無(wú)法考證臨床病人和密切接觸者是否有安徽旅行史，但是可以根據(jù)血清群和分子分型結(jié)果推測(cè)江西C群菌株可能由安徽傳入。到2007年和2008年，健康人群分離株中C群占的比例上升至58.8%和81.5%，提示自2005年C群菌株傳入江西以后，到2007-2008年C群菌株已經(jīng)在健康人群中大量攜帶，但是由于已經(jīng)開(kāi)展C群流腦疫苗的常規(guī)免疫，人群尤其是嬰幼兒童對(duì)C群流腦具有一定的免疫力，所以并未出現(xiàn)C群流腦病例增多的現(xiàn)象。在2012-2015年，病人和密切接觸者分離株均為C群菌株，但是健康人群分離的24株菌株中，沒(méi)有鑒定出C群菌株，可能是由于健康人群抽樣調(diào)查時(shí)未能采集到攜帶C群菌株的人群標(biāo)本。2012-2015年已經(jīng)普遍接種C群流腦疫苗，但是仍然有C群流腦病例發(fā)生，提示應(yīng)該加強(qiáng)C群流腦疫苗免疫和查漏補(bǔ)種，并且開(kāi)展健康人群抗體水平檢測(cè)，研究人群的免疫力水平。

自2003-2004年我國(guó)出現(xiàn)C群流腦病例暴發(fā)以來(lái)，已經(jīng)在全國(guó)20多個(gè)省份發(fā)現(xiàn)C群流腦病例，并且C群菌株幾乎都為ST-4821型[4]。在之前的研究中我們揭示了2008年之前江西省流行的C群菌株為ST-4821型[7]，本研究中揭示江西省2008年至今的流行菌株也是ST-4821型C群菌株，跟全國(guó)情況一致。通過(guò)查詢比對(duì)國(guó)家腦膜炎奈瑟菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究中的PFGE型別NMNh.JX0001型和NMNh.JX0002型是全國(guó)C群菌株的流行菌型。本研究揭示了江西省2005-2015年，C群菌株發(fā)生了由NMNh.JX0001型向NMNh.JX0002型的轉(zhuǎn)變，但是NMNh.JX0001型和NMNh.JX0002型菌株的分布時(shí)間跨度分別為2005-2014年和2006-2014年，提示可能長(zhǎng)期存在著兩種菌型的傳播，其中NMNh.JX0001型菌株的比例在逐年降低，而NMNh.JX0002型菌株的比例在逐年升高。PFGE型別的變遷有可能導(dǎo)致新的流行模式，所以有必要開(kāi)展持續(xù)監(jiān)測(cè)，密切關(guān)注NMNh.JX0002型菌株在人群中的傳播擴(kuò)散以及引起的流腦病例。