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大腸埃希菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常寄生菌，具有致病性，條件性和非條件性致病菌等特點(diǎn)[1]。大腸桿菌通常對(duì)宿主無害，但某些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道致病性大腸桿菌的血清型已有60多種，常見的有O1，O2，O8，O9，O78，O101，O119，O138，O147，O149和O157等[2-7]。致病性大腸桿菌主要以家畜、家禽及其制品為主要傳播載體，可引起食物中毒、胃腸炎等腸道疾病，甚至導(dǎo)致死亡。隨著抗生素在我國(guó)畜牧業(yè)和食品生產(chǎn)過程中的不規(guī)范使用或?yàn)E用，大腸桿菌耐藥菌株不斷增多，耐藥水平及多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)對(duì)食品和公共衛(wèi)生安全造成極大的危害[8]。大腸桿菌不僅可以通過自身基因突變和外源捕獲耐藥基因產(chǎn)生耐藥性，還可以通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等方式將耐藥基因傳遞到腸道或環(huán)境中進(jìn)行垂直和水平傳播，成為動(dòng)物體內(nèi)潛在的耐藥基因庫(kù)[9]。研究表明，動(dòng)物源耐藥菌株和耐藥基因可以通過食物鏈傳給人類，通過食物鏈攝入不但能將致病性耐藥菌傳遞給人類，而且能將內(nèi)源耐藥菌群的耐藥基因擴(kuò)散到環(huán)境中以及傳遞給人類致病菌，使抗菌藥對(duì)人類疾病的治療效果下降或消失，嚴(yán)重威脅人類的健康和發(fā)展[10]。本研究在調(diào)查廣西生鮮畜禽產(chǎn)品源致病性大腸桿菌“O”抗原血清型分布的同時(shí)，還對(duì)已定型菌株進(jìn)行24種常見抗生素的敏感性試驗(yàn)并調(diào)查其與β-內(nèi)酰胺類抗生素、氟喹諾酮類抗生素耐藥基因的流行情況，為動(dòng)物性食品源大腸桿菌引起的食源性疾病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 2015—2016年分離自廣西南寧市、貴港市、梧州市、賀州市等農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的零售生鮮畜禽肉樣品中經(jīng)鑒定獲得的249株致病性大腸桿菌，由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室保存。

1.1.2試驗(yàn)材料 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，M-H瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；致病性大腸桿菌“O”抗原診斷血清購(gòu)于天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司。2× ES Taq PCR Master Mix(包含Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR Buffer)、DL100 DNA Marker 及質(zhì)粒DNA提取試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；24種藥敏紙片：青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢拉啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢他啶、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、阿齊霉素、利福平、林可霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考，購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1致病性大腸桿菌“O”抗原血清型鑒定 常規(guī)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室凍存的食源性致病性大腸桿菌分離株進(jìn)行復(fù)蘇，然后參照試劑盒說明書進(jìn)行血清型鑒定：首先用各種“O”抗原多價(jià)血清(產(chǎn)毒性大腸桿菌O抗原多價(jià)1、多價(jià)2、多價(jià)3、多價(jià)4；腸道致病性大腸桿菌O抗原多價(jià)1、多價(jià)2、多價(jià)3；侵襲性大腸桿菌O抗原多價(jià)1、多價(jià)2)做玻片凝集試驗(yàn)，陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，再與相應(yīng)的單價(jià)血清做玻片凝集試驗(yàn)，并用生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.3藥物敏感性試驗(yàn) 采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行，結(jié)果判斷參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)文件M100-S21。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2.4耐藥基因引物合成 參照文獻(xiàn)[11-14]，擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM、blaCTX-M，氟喹諾酮類抗生素耐藥基因oqxA、oqxB、qnrA、aac(6′)-Ib-cr。詳細(xì)引物信息見表 1。引物由華諾科技有限公司合成。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequences information

1.2.5耐藥基因檢測(cè)及其序列測(cè)定 嚴(yán)格按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明對(duì)菌株進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取，以質(zhì)粒DNA為模板，PCR檢測(cè)各耐藥基因。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2× ES Taq PCR Master Mix 7 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒DNA模板3 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s；各耐藥基因分別按照表1中退火溫度退火40 s，72 ℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。將PCR陽(yáng)性條帶切膠回收，連接到pMD18-T 載體，按分子克隆所述的方法連接、轉(zhuǎn)化、小量提取質(zhì)粒， 送華諾科技有限公司測(cè)序，進(jìn)行比對(duì)，確定基因型。

2 結(jié) 果

2.1致病性大腸桿菌“O”抗原血清型鑒定結(jié)果 采用致病性大腸桿菌“O”抗原診斷血清試劑盒對(duì)249株大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定。結(jié)果顯示：136株可定型，占鑒定菌株的54.6%(136/249)；96株未定型，占鑒定株的38.6%(96/249)；17株自凝，占鑒定菌株的6.8%(17/249)。已定型的136株大腸桿菌分屬25個(gè)血清型，分別為O6、O7、O8、O9、O15、O20、O25、O26、O28、O29、O44、O55、O78、O86、O112、O114、O124、O126、O127a、O128、O136、O142、O143、O144、O164。其中O8(19.85%)、O86(8.82%)、O6(6.62%)、O28(6.62%)和O124(6.62%)為主要的優(yōu)勢(shì)血清型，共占可定型菌株的54.41%(66/136)。詳見表 2。

表2 致病性大腸桿菌“O”抗原血清型鑒定Tab.2 “O” antigen serotype identification of pathogenic E.coli

注：“n”表示已定型菌株數(shù)

2.2藥物敏感性試驗(yàn)以及多重耐藥結(jié)果 對(duì)試驗(yàn)中已定型的136株致病性大腸桿菌進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)株對(duì)24種抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥，耐藥率介于16.18%～100%之間。對(duì)青霉素的耐藥率高達(dá)100%；對(duì)林可霉素、復(fù)方新諾明、利福平、強(qiáng)力霉素、氨芐西林、阿莫西林的耐藥率介于85.30%～98.53%之間；對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢他啶、鏈霉素的耐藥率介于51.47%～71.33%之間；對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、壯觀霉素、阿奇霉素、氟苯尼考的耐藥性介于16.18%～47.79%之間(詳見表3)。136株已定型株全部為多重耐藥菌株，多重耐藥率高達(dá)100%，其中最少對(duì)6種抗菌藥物耐藥，占3.68%(5/136)，最多對(duì)22種抗菌藥物耐藥，占1.47%(2/136)，主要集中在對(duì)12～18種抗菌藥物耐藥，占總數(shù)的72.06%(98/136)。詳見圖1。

圖1 136株致病性大腸桿菌多重耐藥情況Fig.1 Multiple antimicrobial resistance of 136 strains of pathogenic E.coli

表3 136株致病性大腸桿菌對(duì)24種抗生素的敏感性試驗(yàn)Tab.3 Antibiotic susceptibility test in 24 kind of antibiotics for 136 of pathogenic E.coli

2.3耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果 試驗(yàn)中136株已定型菌株對(duì)6種耐藥基因的檢出率為qnrA 91.18%，oqxA 80.88%，oqxB 50.00%，aac(6′)-Ib-cr 35.29%，blaTEM 100.00%，blaCTX-M 23.53%，見表4。

表4 136株致病性大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection of resistance genes in 136 strains of pathogenic E.coli

3 討 論

3.1大腸桿菌致病性血清型鑒定結(jié)果分析 本研究已定型的136株致病性大腸桿菌分屬25個(gè)血清型，其中優(yōu)勢(shì)血清型為O8(19.85%)、O86(8.82%)、O6(6.62%)、O28(6.62%)和O124(6.62%)，表明本研究中動(dòng)物食品源致病性大腸桿菌血清型呈多樣性分布。大腸桿菌的致病性與“O”抗原血清型種類有一定的聯(lián)系，不同致病型大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)“O”抗原血清型不同，且多數(shù)流行的血清型可能會(huì)隨著地域或時(shí)間而發(fā)生變化。謝永平等[6]、陳鳳蓮等[15]調(diào)查研究顯示，廣西地區(qū)豬大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O138、O21、O101、O8、O9、O85；代鵬飛等[1]研究顯示，四川省動(dòng)物源大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O131、O107、O78、O9、O127、O20、O157；張艷英等[16]研究顯示，河北省動(dòng)物性食品源大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O38、O78；余曉豐等[17]研究顯示，浙江地區(qū)食源性致瀉大腸桿菌的主要優(yōu)勢(shì)血清型為O148、O159、O6、O15、O63、O78。以上數(shù)據(jù)表明，同一地區(qū)的大腸桿菌存在多種血清型，且多數(shù)地方有本地的優(yōu)勢(shì)血清型；不同地方的優(yōu)勢(shì)血清型有的相同，有的不同。因此，確定大腸桿菌O抗原血清型有助于流行病學(xué)調(diào)查，疾病診斷，對(duì)防御并控制致病性大腸桿菌傳播有重要意義。同時(shí)也提示相關(guān)人員在進(jìn)行大腸桿菌的免疫預(yù)防中，應(yīng)充分考慮其血清型的多樣性、易變性，尤其是規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)最好每半年進(jìn)行一次血清分型鑒定，以便有針對(duì)性地進(jìn)行免疫。

3.2藥物敏感性試驗(yàn)以及多重耐藥結(jié)果分析 本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有鑒定菌株對(duì)不同抗生素均具有多重耐藥性，多重耐藥率高達(dá)100%，最低耐藥數(shù)為6耐，最高22耐，主要集中在12-18耐，表明本研究中動(dòng)物食品源致病性大腸桿菌耐藥性強(qiáng)，耐藥譜廣。本研究中的致病性大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的青霉素耐藥率高達(dá)100%，對(duì)氨芐西林、四環(huán)素類、利福霉素類、林可霉素類、磺胺類抗生素的耐藥率都高于90%。本課題組研究顯示[18]，與2007年相比，2016年廣西豬源致病性大腸桿菌對(duì)阿莫西林，頭孢曲松、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、氟苯尼考等抗菌藥耐藥率上升，耐藥譜從2007年的以5-11重耐藥為主到2016年的以11重耐藥以上為主，結(jié)合本研究與之前研究數(shù)據(jù)表明廣西致病性大腸桿菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)峻。食物全產(chǎn)業(yè)鏈一般包含環(huán)境、飼料、養(yǎng)殖、屠宰、加工、銷售和消費(fèi)7大環(huán)節(jié)，畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用甚至濫用抗生素是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重的重要原因，由養(yǎng)殖環(huán)節(jié)(尤其是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng))蔓延的耐藥菌及耐藥基因轉(zhuǎn)移對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈、環(huán)境生態(tài)和人群有著巨大影響[19]。由于我國(guó)過去一段時(shí)期對(duì)養(yǎng)殖業(yè)使用抗生素沒有進(jìn)行十分嚴(yán)格的控制，動(dòng)物源和人源細(xì)菌在耐藥譜上的差異尚不清楚，耐藥性傳播機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。建議國(guó)家相關(guān)職能部門定期協(xié)同監(jiān)測(cè)國(guó)內(nèi)臨床分離株、動(dòng)物及其產(chǎn)品中的菌型及其耐藥情況，從而探明動(dòng)物、動(dòng)物源性食品、臨床病人以及相關(guān)環(huán)境中耐藥菌株的分布情況及同型菌株的潛在傳播途徑；并在食物鏈不同階段或關(guān)鍵控制點(diǎn)上遏制耐藥病原菌、耐藥細(xì)菌、耐藥基因的傳播。獸醫(yī)與人醫(yī)攜手緊密合作，為保護(hù)國(guó)民健康、公共衛(wèi)生和食品安全作出貢獻(xiàn)。

3.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果分析 細(xì)菌攜帶耐藥基因是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一[21]。耐藥基因位于一個(gè)可移動(dòng)的質(zhì)粒中，是耐藥性快速轉(zhuǎn)移傳播的關(guān)鍵因素，在質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移作用下，耐藥基因可整合至新宿主的質(zhì)粒中并進(jìn)行有效表達(dá)，使得新宿主快速獲得對(duì)某種或某類抗菌藥物的耐藥性，同時(shí)新宿主的耐藥譜變得更廣[18]。本研究藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示136株已定型株對(duì)試驗(yàn)中β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率為58.82%～100%，耐藥基因blaTEM和blaCTX-M的檢出率分別為100%和23.53%；對(duì)氟喹諾酮類抗生素的耐藥率為21.32%、22.79%，耐藥基因檢出率分別為35.29%～91.18%。表明本研究中大多數(shù)耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的大腸桿菌都攜帶相對(duì)應(yīng)的耐藥基因，耐氟喹諾酮類抗生素大腸桿菌攜帶相對(duì)應(yīng)的耐藥基因較少，攜帶耐藥基因的大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥表型基本一致，提示多種耐藥基因共存使細(xì)菌獲得多重耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增大。

4 結(jié) 論

綜上所述，廣西動(dòng)物性食品源致病性大腸桿菌血清型呈多樣性分布；分離株的耐藥情況嚴(yán)重，臨床日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象與耐藥基因的普遍存在有重要的關(guān)系。同時(shí)攜帶多種耐藥基因的大腸桿菌的數(shù)量不斷上升,大腸桿菌呈多重耐藥的趨勢(shì),這將降低抗菌藥物的有效率,增大監(jiān)測(cè)大腸桿菌耐藥情況的難度,加大大腸桿菌耐藥機(jī)制研究的復(fù)雜度。