任曉曦 趙 云 韓玉坤 鄭 焱 楊 慧 張建亮

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院 帕金森病研究所 教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要的病理改變是黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失及路易體形成〔1,2〕。α-突觸核蛋白是路易體內(nèi)的主要成分。證據(jù)表明，α-突觸核蛋白可能是一種朊蛋白樣的蛋白質(zhì)，他可以聚集成有毒的多聚體形式并在細(xì)胞間成“種子”樣傳播〔3〕。目前認(rèn)為α-突觸核蛋白的寡聚體，可能就是“種子”的一種形式，α-突觸核蛋白的寡聚體在被細(xì)胞攝取之后，可以使細(xì)胞內(nèi)正常的α-突觸核蛋白錯(cuò)誤折疊并以它為核心發(fā)生聚集，在聚集的過程中不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，還會(huì)有新的α-突觸核蛋白寡聚體形成。新的α-突觸核蛋白寡聚體被細(xì)胞排出后，繼續(xù)影響周圍細(xì)胞，開啟一個(gè)惡性循環(huán)〔4〕。因此如果能及早檢測(cè)出傳播的α-突觸核蛋白，不僅可以為PD的診斷提供重要的證據(jù)，而且還能在PD的早期對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療，緩解PD病理進(jìn)程。本文中，我們利用高靈敏的熒光素酶human Gaussiaprinceps luciferase(hGLuc)作為報(bào)告蛋白〔5〕，構(gòu)建了一套可以檢測(cè)α-突觸核蛋白聚集及傳播的系統(tǒng)，該方法可以有效地檢測(cè)α-突觸核蛋白的聚集及在細(xì)胞間的傳播，這為PD的早期診斷提供了思路，為PD的早期干預(yù)治療提供了可能。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM和胎牛血清(FBS，Gibco)，線性聚乙烯亞胺(MW，25 000，PEI)(polysciences,Inc.)，腔腸素(Yeasen),α-突觸核蛋白抗體(BD),α-actin抗體(冠星宇)，Phusion高保真DNA聚合酶，Dpn1(NEB)，Amicon? Ultra-4 3KD離心過濾器(Millipore)。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建 模板pCDNA3.1(+)-α-突觸核蛋白，hGLuccDNA序列(優(yōu)寶生物)。構(gòu)建pCDNA3.1(+)-α-突觸核蛋白-linker-hGLucN，模板上游引物：GGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATAC；模板下游引物：TAACCACTAGTCCAGTGTGGTGG；片段上游引物：CTACGAACCTGAAGCCGGAGGCGGAGGCTCCGGAGGCGGA GGCTCCGCCAAGCCCACCGAGAAC；片段下游引物：CACTGGACTAGTGGTTAGCCTATGCCGCCCTGTG；構(gòu)建pCDNA3.1(+)-α-突觸核蛋白-linker-hGLucC，模板上游引物：GGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATAC；模板下游引物：TAACCACTAGTCCAGTGTGGTGG；片段上游引物：CTACGAACCTGAAGCCGGAGGCGGAGGCTCCG-GAGGCGGAGGCTCCGAGGCGATCGTCGACATTCC；片段下游引物：CACTGGACTAGTGGTTAGTCACCACCGGCCCCC。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將SK-N-SH細(xì)胞接種于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度在80%左右時(shí)利用PEI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4Western印跡 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液，利用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜半干轉(zhuǎn)1h,封閉后孵育抗體。

1.5Dot印跡 轉(zhuǎn)染48 h后，收集培養(yǎng)基，使用3 kD離心過濾器將3 500 μl培養(yǎng)基濃縮至100 μl,取1 μl滴與硝酸纖維素(NC)膜上，晾干后用5%脫脂牛奶封閉，隨后孵育抗體。

1.6α-突觸核蛋白預(yù)制原纖維制備 將人源重組α-突觸核蛋白單體溶于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)中，終濃度為5 mg/ml。隨后1 000 r/min，37℃震搖7 d。100 000 r/min離心30 min，分離出聚集成纖維狀態(tài)的α-突觸核蛋白，分裝后-80℃保存。

1.7熒光素酶活性檢測(cè) 將SK-N-SH細(xì)胞接種到96孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉培養(yǎng)基用0.01 mol/L PBS洗3遍，加入Coelenterazine，native,20 μmol/L，酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 6 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BiFC分析法原理及質(zhì)粒構(gòu)建 為了構(gòu)建BiFC分析法〔6〕，首先要將hGLuc的N端(1～93)和hGLuc的C端(94～169)分別與α-突觸核蛋白的C端融合〔5,7,8〕，記作L1和L2。為了降低蛋白質(zhì)空間構(gòu)象產(chǎn)生的空間位阻，我們?cè)讦?突觸核蛋白和hGLuc的N端/C端之間插入了一段由10個(gè)氨基酸(GGGGSGGGGS)組成的連接子(linker)〔6〕，以使hGLuc的N端/C端可以相對(duì)自由的轉(zhuǎn)動(dòng)(圖1)。這樣，在同時(shí)表達(dá)L1和L2的細(xì)胞中，如果α-突觸核蛋白發(fā)生聚集，那么hGLuc的N端和C端就會(huì)隨之相互靠近，使hGLuc恢復(fù)酶活力?；謴?fù)酶活力的hGLuc可以催化底物Coelenterazine分解，產(chǎn)生可以被探查到的熒光信號(hào)，見圖1。

圖1 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖及BiFC分析法原理圖

2.2融合蛋白可以在SK-N-SH細(xì)胞中表達(dá) 質(zhì)粒構(gòu)建完成后，我們接下來在SK-N-SH細(xì)胞中驗(yàn)證融合蛋白是否表達(dá)。我們利用轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)入SK-N-SH細(xì)胞中，48 h后利用Western印跡檢測(cè)質(zhì)粒表達(dá)情況。結(jié)果顯示，兩種質(zhì)粒均可在SK-N-SH細(xì)胞中表達(dá)，見圖2。

2.3BiFC分析法可以檢測(cè)α-突觸核蛋白的聚集 在SK-N-SH細(xì)胞系中同時(shí)表達(dá)L1和L2，48 h后，加入底物Coelenterazine，利用酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果顯示，共同轉(zhuǎn)染組(171.33±14.27)與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組(48.50±5.41)熒光強(qiáng)度差異顯著，這說明L1和L2隨著α-突觸核蛋白聚集而相互靠近，從而使hGLuc恢復(fù)了酶活性。為排除L1或L2單獨(dú)就具有酶活性的情況，將L1或L2分別轉(zhuǎn)染入SK-N-SH細(xì)胞系中，48 h后，加入底物Coelenterazine，利用酶標(biāo)儀讀數(shù)，結(jié)果顯示，單獨(dú)轉(zhuǎn)染L1組(42.33±6.13)和單獨(dú)轉(zhuǎn)染L2組(44.83±8.51)與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞組沒有明顯差別，這說明L1或L2單獨(dú)不具有酶活性。

圖2 Western印跡檢測(cè)融合蛋白L1和L2在SK-N-SH 細(xì)胞中表達(dá)

2.4結(jié)果特異性驗(yàn)證 體外通過GST蛋白純化的方式得到人源重組α-突觸核蛋白單體。隨后將α-突觸核蛋白單體在體外震搖7 d，獲得α-突觸核蛋白預(yù)制原纖維(PFF)。因?yàn)楫?dāng)α-突觸核蛋白聚集成纖維狀態(tài)時(shí)，會(huì)在溶液中形成沉淀，所以通過超速離心的方式可以將未聚集成纖維狀態(tài)的α-突觸核蛋白，即上清液與聚集成纖維狀態(tài)的α-突觸核蛋白，即沉淀分離開來，見圖3。最后將纖維狀態(tài)的α-突觸核蛋白經(jīng)過超聲處理后，利用BiFC分析法檢測(cè)，結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度隨著PFF濃度的增高而增高，當(dāng)體系中PFF濃度為0.03 μg/μl時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增高(1.27±0.08)，這說明利用BiFC分析法可以很好地表征α-突觸核蛋白的聚集，同時(shí)也說明了該方法可以檢測(cè)到α-突觸核蛋白聚集體的存在。

1：α-突觸核蛋白單體；2：上清液；3：沉淀圖3 人源重組α-突觸核蛋白SDS-PAGE

2.5BiFC分析法可以檢測(cè)到α-突觸核蛋白的傳播 將L1或L2及空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入SK-N-SH細(xì)胞中，48 h后收集培養(yǎng)基，記為L(zhǎng)1(m)、L2(m)和空載質(zhì)粒(m)。Dot印跡結(jié)果證明了L1(m)和L2(m)中有α-突觸核蛋白的存在，而空載質(zhì)粒(m)中沒有(圖4)。隨后將L2(m)和空載質(zhì)粒(m)分別加入到已經(jīng)轉(zhuǎn)染了L1的SK-N-SH細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染36 h后)，記為L(zhǎng)1+L2(m)組和L1+空載質(zhì)粒(m)組；L1(m)和空載質(zhì)粒(m)分別加入到已經(jīng)轉(zhuǎn)染了L2的SK-N-SH細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染36 h后)，記為L(zhǎng)2+L1(m)組和L2+空載質(zhì)粒(m)組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，加入底物Coelenterazine，利用酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果顯示，L1+L2(m)組的熒光強(qiáng)度(26.25±2.17)要明顯高于L1+空載質(zhì)粒(m)組(21.00±0.89)，同樣L2+L1(m)組的熒光強(qiáng)度(29.20±5.00)要明顯高于L2+空載質(zhì)粒(m)組(19.00±2.28)。而L1+L2(m)組和L2+L1(m)組的熒光強(qiáng)度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，L1+空載質(zhì)粒(m)組與L2+空載質(zhì)粒(m)組的熒光強(qiáng)度也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果說明BiFC分析法可以檢測(cè)到α-突觸核蛋白在細(xì)胞間的傳播。

圖4 Dot印跡檢測(cè)培養(yǎng)基中的α-突觸核蛋白

3 討 論

在本研究中，我們利用高靈敏的熒光素酶hGLuc作為報(bào)告蛋白，將其N端(1～93)與C端(94～169)分別與α-突觸核蛋白的C端融合，并將L1和L2在SK-N-SH細(xì)胞中共同表達(dá)，結(jié)果顯示L1和L2隨著α-突觸核蛋白聚集而相互靠近，從而使hGLuc恢復(fù)了酶活性。隨后我們加入PFF，誘導(dǎo)內(nèi)源性α-突觸核蛋白的聚集，結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度隨著PFF濃度的增高而增高，當(dāng)體系中PFF濃度為0.03 μg/μl時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增高，這說明利用BiFC分析法可以很好地表征α-突觸核蛋白的聚集，同時(shí)也說明了該方法可以檢測(cè)到α-突觸核蛋白聚集體的存在。最后將L1和L2分別在SK-N-SH細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果表明BiFC分析法可以檢測(cè)到α-突觸核蛋白在細(xì)胞間的傳播。

α-突觸核蛋白是PD中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，它可以聚集成有毒的多聚體形式，α-突觸核蛋白可以在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播〔9,10〕。不僅如此，其寡聚體猶如一顆種子，在進(jìn)入細(xì)胞后可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)正常的α-突觸核蛋白發(fā)生聚集并釋放到細(xì)胞外從而影響周圍細(xì)胞，開啟一個(gè)惡性循環(huán)。而這個(gè)惡性循環(huán)無疑是PD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。但是傳統(tǒng)方法，如非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，密度梯度離心法，排阻色譜或者原子力顯微鏡觀察等，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也很難檢測(cè)到α-突觸核蛋白的聚集和在細(xì)胞間的傳播。本研究中的BiFC分析法為檢測(cè)α-突觸核蛋白的聚集和在細(xì)胞間的傳播提供了新的解決思路。這不僅為PD的早期診斷提供了思路，為PD的早期干預(yù)治療提供了可能，而且也為抑制α-突觸核蛋白聚集的藥物篩選提供了幫助。