老志平 陳素賢 李 倫 萬義增

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

大腸癌惡變的機制很多，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、細(xì)胞凋亡機制、原癌基因的激活、抑癌基因的失活及通路的紊亂等〔1，2〕。Twist是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可以促進細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增強細(xì)胞運動和遷移能力〔3〕。C-myc是一種具有惡性轉(zhuǎn)化作用的原癌基因，其表達的C-myc蛋白與細(xì)胞分化、生長、增殖及凋亡有關(guān)，原癌基因C-myc可以使細(xì)胞進入無限增殖狀態(tài)，同時能夠促進細(xì)胞分裂，這與多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系〔4〕。目前國內(nèi)外已有大量研究表明腫瘤的發(fā)生是多種致病因子共同作用的結(jié)果，而Twist、C-myc蛋白在大腸癌中分別都進行過研究，本實驗主要探討Twist蛋白及C-myc蛋白在大腸癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及兩者在臨床及病理診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1資料 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)切除的標(biāo)本50例，年齡42～80歲，平均61歲；患者均為原發(fā)，術(shù)前均未接受化療及放療，同時選取相應(yīng)的正常大腸黏膜組織作為對照組。

1.2方法 采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)法檢測50例大腸癌及正常大腸黏膜組織Twist、C-myc蛋白的表達。標(biāo)本均以10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)脫臘，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。染色步驟按試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作空白對照。

1.3評分標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化染色結(jié)果以在表達部位出現(xiàn)黃色到褐色顆粒為陽性。結(jié)果判斷參考如下標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色強度評分：無色(0分)、黃色(1分)、棕色(2分)、褐色(3分)。根據(jù)著色細(xì)胞的百分比評價染色范圍：0%～5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～100%(3分)。染色強度和范圍之積作為最終染色評分：0～3分為陰性，4～5分弱陽性(+)，6～7分中陽性()，8～9分強陽性()。

1.4統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗和Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1Twist Twist蛋白主要表達于細(xì)胞核，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)中也有表達，該蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率(80%)明顯高于正常大腸黏膜組織(8%)(圖1)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨其病理特征的改變其表達情況也不同，分化越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期增加Twist陽性表達隨之增加(P<0.05)，而與患者的性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，見表1。

2.2C-myc C-myc在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均有表達，該蛋白在正常的大腸黏膜組織中不表達，在大腸癌組織中表達率為80%，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)，其陽性表達率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高而增高、Dukes分期越高陽性表達率越高(P<0.05)，而與患者的腫瘤分化程度、年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，見表1。

圖1 Twist、C-myc在正常大腸黏膜與大腸癌組織中的表達(免疫組化，×200)

因素nTwist(n=40)C-myc(n=40)性別 男262120 女241920 χ2/P值0.020/0.8890.321/0.575年齡 >61歲231917 ≤61歲272123 χ2/P值0.181/0.6730.986/0.326分化 高-中分化322226 低分化181814 χ2/P值6.402/0.0120.087/0.771淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有292627 無211413 χ2/P值4.023/0.0477.410/0.007Dakes分期 Ⅰ+Ⅱ231415 Ⅲ+Ⅳ272625 χ2/P值9.742/0.0025.817/0.017腫瘤直徑 ≥5 cm282322 <5 cm221718 χ2/P值0.183/0.6720.081/0.778

2.3Twist、C-myc在結(jié)腸癌組織中表達的相關(guān)性 Twist蛋白高表達的大腸癌組織中C-myc同時高表達(r=0.454，P<0.05)，但是在正常的大腸組織中均不表達。

3 討 論

臨床上對大腸癌的治療方面主要還是手術(shù)治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率很高〔5〕。因此對于大腸癌的發(fā)生發(fā)展機制及腫瘤的靶向治療成為研究的熱點。

腫瘤的發(fā)生是機體在多種致病因素作用下共同完成的，主要以細(xì)胞的凋亡抑制及細(xì)胞增殖失控為主要特征，在腫瘤的發(fā)生過程中起重要作用〔6〕。Twist作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移方面起重要作用〔7〕。本研究結(jié)果提示Twist蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。Twist基因不僅參與胚胎的發(fā)育及新血管的生成，同時與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔8，9〕，這與本研究結(jié)果一致。本實驗說明隨著臨床分期的增高，Twist蛋白的陽性表達水平也顯著增高，其浸潤及轉(zhuǎn)移能力可能也越強。Twist基因主要通過抑制E鈣黏蛋白的表達來增加腫瘤的遷移及侵襲能力〔10，11〕，這與本實驗研究結(jié)果相符。本文提示Twist基因在腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，說明表達越高的大腸癌組織的侵襲性越強。王偉等〔12〕通過對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)Twist基因在參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的同時還增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。本文說明Twist在決定腫瘤的惡性程度中起重要作用，這與口腔鱗癌及胃癌的研究結(jié)果相符〔13，14〕。

C-myc基因是在人體組織中普遍存在的基因，它能夠控制細(xì)胞周期，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，有研究證明，C-myc基因?qū)δ[瘤的生長具有雙向調(diào)節(jié)的作用，它既可以促進細(xì)胞增殖，也可以促進細(xì)胞凋亡〔15〕。C-myc基因在人體內(nèi)過度表達可以刺激細(xì)胞無限增殖，同時也可以有效誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔16〕。本研究結(jié)果說明C-myc參與了大腸癌的形成及發(fā)展。有研究表明該基因的過度表達可以使細(xì)胞脫離正常的有絲分裂軌道，誘導(dǎo)靜止期的細(xì)胞進入細(xì)胞分裂期，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，引起腫瘤的發(fā)生〔17〕。本實驗說明該基因參與了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。本文說明C-myc基因的表達與腫瘤的分化程度無關(guān)，這與肝細(xì)胞癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌等研究結(jié)果不符〔18，19〕。本實驗說明分期越高C-myc陽性表達越高。

前列腺癌中的研究表明C-myc基因與其他許多基因存在協(xié)同作用，共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔15〕。本實驗說明Twist和C-myc在調(diào)控細(xì)胞周期及控制凋亡等方面均發(fā)揮重要作用。已有研究證明，Twist蛋白對凋亡起調(diào)節(jié)作用主要是通過減少p53的上游調(diào)控因子生長素響應(yīng)因子(ARF)的表達而影響p53的穩(wěn)定，干擾 ARF-P53調(diào)控通路，阻止C-myc誘導(dǎo)的凋亡，這種通路在其他腫瘤中已被證實〔6〕，但在結(jié)直腸癌中的研究較少。本實驗說明在癌癥形成的早期C-myc因子在一定程度上對Twist蛋白同樣起到調(diào)控的作用，說明Twist、C-myc兩種因子存在雙向調(diào)節(jié)的關(guān)系，協(xié)同促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。綜上，聯(lián)合檢測Twist和C-myc蛋白在結(jié)直腸癌中的表達，對預(yù)測結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有一定的參考價值。