汪靖園，王林川，肖 堯，阮競(jìng)雄，田旭東，閆 芳

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710061；2.西安市第三醫(yī)院輸血科，西安 710018)

目前，化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光及ELISA技術(shù)廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒特異性抗體(TP)、艾滋病病毒(HIV)血清標(biāo)志物的檢測(cè)。不同檢測(cè)方法或儀器之間結(jié)果是否具有可比性？檢測(cè)性能是否與廠家聲明一致？能否滿足科室質(zhì)量目標(biāo)要求等問題需要對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)來確認(rèn)。為此，我們參照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明[1]，采用 CLSI-EP方案[2～4]對(duì)這兩種檢測(cè)系統(tǒng)的性能進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 來源于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院患者樣本及衛(wèi)計(jì)委2016，2017年感染性疾病血清標(biāo)志物A，C能力驗(yàn)證(proficiency testing，PT)樣本。

1.2 試劑和儀器 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：來源于北京康徹思坦，包括HBsAg(4IU/ml)，HBsAb(30mIU/ml)，HBeAg(4NCU/ml)，HBeAb(8NCU/ml)，HBcAb(4NCU/ml)，Anti-HCV(8NCU/ml)，Anti-HIV(8NCU/ml)，Anti-TP(特異)(400mIU/ml)。其中，IU為國(guó)際單位(international unit)；NCU即國(guó)家臨床單位(national clinical unit)，由衛(wèi)計(jì)委臨檢中心制定。檢測(cè)系統(tǒng)：科華ELISA(上?？迫A)，i2000sr化學(xué)發(fā)光流水線(美國(guó)雅培，儀器序列號(hào)分別為52691，52693，52695，50143，54290)。

1.3 方法 準(zhǔn)確度驗(yàn)證：統(tǒng)計(jì)衛(wèi)計(jì)委2016，2017年度感染性疾病血清標(biāo)志物A(乙肝標(biāo)志物，丙肝抗體)，C(梅毒特異性抗體，HIV抗體)共6次，30個(gè)樣本PT回報(bào)結(jié)果。符合率≥80%，驗(yàn)證通過。

檢出限確認(rèn)：HBsAg，HBsAb廠家聲明檢出下限，科華不高于0.1 IU/ml和10 mIU/ml，i2000sr不高于0.05 IU/ml和10 mIU/ml。使用生理鹽水稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備檢測(cè)樣本，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)后獲得線性回歸方程，見表1。然后制備臨界值附近濃度樣本，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)20次測(cè)定。以定量項(xiàng)目偏倚≤允許總誤差(total allowable error，TEa)，定性項(xiàng)目陽性率≥95%的最低濃度確認(rèn)為檢出限。

一致性驗(yàn)證(方法學(xué)比對(duì))：采用ELISA，對(duì)i2000sr七種標(biāo)志物(除HIV)結(jié)果分別為陰性和陽性各10例患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中弱陽性至少包含2例。弱陽性樣本包括：HBsAg(0.14，0.97 IU/ml)，HBsAb(12.87，12.95 mIU/ml)，HBeAg(1.09，1.607 NCU/ml)，HBeAb(0.91，0.89，0.88，0.86 NCU/ml)，HBcAb(1.6，1.74，1.77，1.8，1.87 NCU/ml)，Anti-HCV(1.45，2.44 mIU/ml)，Anti-TP(1.34，1.37，1.65 NCU/ml)。

表1 檢出限確認(rèn)樣本的制備

一致性驗(yàn)證(儀器間比對(duì))：定量項(xiàng)目(HBsAg，HBsAb)儀器間比對(duì)采用三臺(tái)i2000sr對(duì)分布于低、中、高水平各20份患者樣本進(jìn)行測(cè)定，以中位數(shù)作為靶值。觀察誤差(observed error)≤1/2TEa，濃度誤差指數(shù)(error index)絕對(duì)值≤1，驗(yàn)證通過。定性檢測(cè)項(xiàng)目(除HIV)儀器間比對(duì)評(píng)價(jià)方案參照方法學(xué)比對(duì)進(jìn)行。計(jì)算公式：觀察誤差(%)=(測(cè)定結(jié)果-靶值)×100/靶值，濃度誤差指數(shù)=(測(cè)定結(jié)果-靶值)/(靶值×TEa)。

精密度驗(yàn)證：參照CLSI-EP15-A2[7]，選擇兩個(gè)濃度水平患者樣本(HIV精密度評(píng)價(jià)選擇雅培低、中水平室內(nèi)質(zhì)控品)，每個(gè)水平每日測(cè)定一批(重復(fù)測(cè)定3次)，連續(xù)5天，計(jì)算批內(nèi)不精密度和室內(nèi)不精密度。CV同時(shí)滿足：(i)批內(nèi)不精密度≤1/4TEa；(ii)室內(nèi)不精密度≤1/2TEa，驗(yàn)證通過。計(jì)算公式如下：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 精密度，定量項(xiàng)目多臺(tái)儀器間比對(duì)，線性范圍驗(yàn)證使用EP Evaluator 11軟件(Data Innovaions LLC，Suite South Burlington，Vermont，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)室允許總誤差(TEa)設(shè)定為30%。一致性驗(yàn)證采用Kappa檢驗(yàn)，系數(shù)≥0.75驗(yàn)證通過。線性范圍驗(yàn)證中，采用t分布(t-statistics)判斷是否存在非線性系數(shù)。通過得到的t值與t界值比較，t值>t界值，則該組數(shù)據(jù)存在非線性系數(shù)。在本研究中，其自由度為8(置信度設(shè)置為0.95)，對(duì)應(yīng)的t界值為2.3，即t>2.3時(shí)表明存在非線性系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 對(duì)衛(wèi)計(jì)委2016，2017年度感染性疾病血清標(biāo)志物A，C共6次30個(gè)PT樣本，使用雅培i2000sr和科華ELISA兩種系統(tǒng)各自檢測(cè)一次。根據(jù)PT回報(bào)結(jié)果，兩種檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果均與預(yù)期一致，準(zhǔn)確度驗(yàn)證通過。

2.2 檢出限確認(rèn) HBsAg濃度為0.05，0.08，0.1 IU/ml及HBsAb濃度為10 mIU/ml樣本的20次檢測(cè)，科華ELISA陽性率分別為5%，95%，100%，100%。表明科華ELISA對(duì)HBsAg，HBsAb檢出下限分別為0.08 IU/ml，10 mIU/ml，與廠家聲明一致。i2000sr對(duì)濃度分別為0.05 IU/ml，10 mIU/ml的HBsAg和HBsAb樣本20次檢測(cè)，范圍分別為0.051 9～0.063 9 IU/ml，10.24～11.18 mIU/ml，與理論濃度偏倚均小于TEa，檢出限與廠家聲明一致。利用線性回歸方程制備接近理論臨界值濃度的樣本，20次測(cè)定獲得95%陽性率的最低濃度，HBeAg，HBeAb，HBcAb，Anti-HCV，Anti-TP和Anti-HIV科華分別為0.8 NCU/ml，4.4 NCU/ml，3.2 NCU/ml，0.8 NCU/ml，20 mIU/ml和0.5 NCU/ml；i2000sr分別為0.225 NCU/ml，1 NCU/ml，1.8 NCU/ml，0.45 NCU/ml，20 mIU/ml和2.88 NCU/ml，見表2。

表2 兩種檢測(cè)系統(tǒng)八種血清標(biāo)志物檢出限確認(rèn)結(jié)果

2.3 一致性驗(yàn)證 對(duì)七種血清標(biāo)志物(除Anti-HIV)i2000sr結(jié)果已知的患者樣本，采用ELISA檢測(cè)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)：10例陰性樣本，除1例HBsAb結(jié)果為陽性(i2000sr：0.44 mIU/ml；科華：1.28 mIU/ml)，其余均為陰性。10例陽性樣本，科華陽性檢出數(shù)為8～10例。兩種方法一致性檢驗(yàn)Kappa系數(shù)分布于0.8～0.9，方法學(xué)比對(duì)通過。儀器間比對(duì)：定性項(xiàng)目(HBeAg，HBeAb，HBcAb，Anti-HCV，Anti-TP)，兩臺(tái)儀器(序列號(hào)：52691，52693)檢測(cè)結(jié)果一致，Kappa系數(shù)均為1。定量項(xiàng)目(HBsAg，HBsAb)，3臺(tái)儀器觀察誤差均小于1/2TEa。HBsAg濃度誤差指數(shù)，52695，50143，54290儀器分布范圍分別為-0.39～0.56，-0.38～0.42，-0.28～0.28。HBsAb濃度誤差指數(shù)分別為-0.27～0.21，-0.39～0.30，-0.40～0.47，i2000sr儀器間比對(duì)通過，見圖1。

2.4 精密度驗(yàn)證 i2000sr精密度驗(yàn)證結(jié)果見表3。八項(xiàng)標(biāo)志物，水平1批內(nèi)不精密度CV分布范圍為2.05%～4.57%，室內(nèi)不精密度CV范圍為2.54%～10.03%；水平2批內(nèi)不精密度CV分布范圍為1.10%～7.01%，室內(nèi)不精密度CV分布范圍為1.90%～8.61%。批內(nèi)CV小于1/4TEa(7.5%)，室內(nèi)CV小于1/2TEa(15%)，精密度驗(yàn)證通過。

(A)檢測(cè)結(jié)果散點(diǎn)圖；(B)序列號(hào)分別為52695，50143，54290儀器低、中、高濃度20例樣本檢測(cè)，濃度誤差指數(shù)(Error Index)分布。

表3 雅培i2000sr八種血清標(biāo)志物精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.5 線性范圍驗(yàn)證 使用生理鹽水對(duì)接近線性范圍上限的患者樣本進(jìn)行稀釋，制備線性范圍驗(yàn)證的樣本。短時(shí)間內(nèi)對(duì)其按照從低到高，然后從高到低二次檢測(cè)，目視均值無離群點(diǎn)。多項(xiàng)式回歸分析見表4，HBsAg三項(xiàng)回歸方程不存在非線性系數(shù)b3(t值1.8<2.3)，而二項(xiàng)回歸方程存在非線性系數(shù)b2(t值3.7>2.3)，因此HBsAg最適模型為二項(xiàng)回歸模型。與此類似，HBsAb二項(xiàng)回歸方程非線性系數(shù)b2，三項(xiàng)回歸方程非線性系數(shù)b3，對(duì)應(yīng)的t值均>2.3，故兩種回歸方程均存在非線性系數(shù)。但三項(xiàng)回歸方程標(biāo)準(zhǔn)誤最小，因此三項(xiàng)回歸模型為HBsAb最適模型。各個(gè)點(diǎn)最適模型與線性模型偏倚均小于1/2TEa，見圖2。表明i2000srHBsAg，HBsAb線性范圍分別為0.73～245 IU/ml，4.21～960.89 mIU/ml，與雅培說明書一致，見表5。

表4 雅培i2000sr HBsAg，HBsAb線性范圍驗(yàn)證多項(xiàng)式回歸分析

表5 雅培i2000sr HBsAg，HBsAb線性范圍驗(yàn)證不同模型擬合結(jié)果

3 討論

提高實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理水平和檢測(cè)技術(shù)能力，為臨床和患者提供可靠的檢測(cè)結(jié)果，已成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生存發(fā)展和學(xué)科建設(shè)的關(guān)鍵?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》和《全國(guó)臨床操作規(guī)程》規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室在開展新項(xiàng)目之前，檢測(cè)系統(tǒng)更換或者發(fā)生重大改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證[5]。CNAS-CL39明確指出，免疫學(xué)定性項(xiàng)目性能驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)參考試劑盒說明書的性能參數(shù)進(jìn)行，但至少應(yīng)包括檢出限、符合率，如為定量方法應(yīng)驗(yàn)證精密度[1]。國(guó)內(nèi)外已有較多文獻(xiàn)對(duì)以羅氏或雅培為代表的感染性疾病血清標(biāo)志物發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)[6～11]，但其局限性在于：①評(píng)價(jià)主要基于HBV[10]或HBsAg[6～9]等單一指標(biāo)性能；②性能驗(yàn)證涉及的參數(shù)不夠全面，多限于精密度[9，10]，不同儀器對(duì)患者檢出能力比較[7]，不同儀器間相關(guān)性[6～8]；③僅評(píng)價(jià)發(fā)光與ELISA的一致性[11]。本文對(duì)同時(shí)允許于我室的雅培i2000sr化學(xué)發(fā)光和科華ELISA兩種檢測(cè)系統(tǒng)4種感染性疾病8項(xiàng)血清標(biāo)志物的性能進(jìn)行了全面的驗(yàn)證和比較。

定性試驗(yàn)由于CV較大，對(duì)其精密度常不做評(píng)價(jià)。CLSI EP12-A2通過對(duì)臨界值±20%以外濃度樣本10天(每日兩次)或20天(每日一次)檢測(cè)，能否獲得≥95%陽性率、陰性率來評(píng)價(jià)其再現(xiàn)性[4]。對(duì)于定量檢測(cè)系統(tǒng)，EP15-A2通過對(duì)兩種以上水平樣本連續(xù)5天(每日3次)檢測(cè)來確認(rèn)其精密度[2]。本次對(duì)八種標(biāo)志物兩個(gè)水平樣本檢測(cè)中，i2000sr批內(nèi)不精密度為1.10%～7.01%(<1/4TEa)，室內(nèi)不精密度為1.90%～10.03%(<1/2TEa)，表明該系統(tǒng)精密度滿足科室要求，也與國(guó)內(nèi)其他研究結(jié)果接近[9，10]。檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)是近年來人們比較關(guān)注的話題，通過能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)以及實(shí)驗(yàn)室定期外部?jī)?nèi)部比對(duì)是實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)前提。按照CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》的要求，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)。對(duì)沒有開展能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過與其他實(shí)驗(yàn)室比對(duì)的方式判斷檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性[12]。實(shí)驗(yàn)室同一項(xiàng)目使用兩套及以上檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)至少每年進(jìn)行1次內(nèi)部比對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果一致性[1]。在本次驗(yàn)證中，科華ELISA與i2000sr化學(xué)發(fā)光對(duì)衛(wèi)計(jì)委HBV，HCV，TP和HIV 8項(xiàng)血清標(biāo)志物30份PT樣本準(zhǔn)確度均為100%。方法學(xué)和儀器間比對(duì)，定性項(xiàng)目Kappa值為0.8～1，定量項(xiàng)目觀察誤差，濃度誤差指數(shù)絕對(duì)值分別小于1/2TEa和1。表明兩種檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確度、一致性均能滿足實(shí)驗(yàn)室要求。盧婷等[11]在類似檢測(cè)中，i2000sr與ELISA在乙肝標(biāo)志物總體一致性(符合率)達(dá)99%～100%。檢出限的確認(rèn)是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物檢出能力的重要環(huán)節(jié)。在本次評(píng)價(jià)中，兩種檢測(cè)系統(tǒng)HBsAg，HBsAb，Anti-TP檢出限差異不大，但i2000sr對(duì)HBeAg，HBeAb，HBcAb和Anti-HCV檢出能力明顯優(yōu)于科華，而科華對(duì)Anti-HIV檢出能力優(yōu)于i2000sr。線性范圍驗(yàn)證，HBsAg，HBsAb分別為0.73～245 IU/ml，4.21～960.89 mIU/ml，與雅培聲明(HBsAg：0～250 IU/ml；HBsAb：0～1 000 mIU/ml)接近。

(A)多項(xiàng)式回歸分析，線性擬合曲線與最適模型擬合曲線；(B)系列分析樣本檢測(cè)結(jié)果殘差分布圖。

綜上，在術(shù)前八項(xiàng)檢測(cè)中，雅培i2000sr化學(xué)發(fā)光和科華ELISA準(zhǔn)確度、檢出限、精密度和線性范圍等性能指標(biāo)與廠家聲明一致并能滿足實(shí)驗(yàn)室要求，同時(shí)兩種系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果具有很高的一致性。在感染疾病四種關(guān)鍵血清標(biāo)志物(HBsAg，Anti-HCV，Anti-TP，Anti-HIV)的常規(guī)篩查中，兩種系統(tǒng)對(duì)HBsAg，Anti-TP檢出能力相近，i2000sr僅在Anti-HCV檢出能力上明顯優(yōu)于科華，但科華對(duì)Anti-HIV檢出能力優(yōu)于i2000sr。