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(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.上海奶牛育種中心有限公司；3.光明牧業(yè)有限公司)

奶牛在懷孕后體內(nèi)會(huì)生成一種妊娠蛋白，這種蛋白稱為妊娠特異性蛋白B(PSPB)。它是由胚胎分離得到的幾種天冬氨酸蛋白酶家族的混合物。1987年Garth.Sasser教授發(fā)現(xiàn)[1-2]，PSPB可用作牛羊等反芻動(dòng)物早期孕檢的有效標(biāo)記物，然而它只有當(dāng)奶牛懷孕時(shí)才會(huì)釋放。隨著配種時(shí)間的延長(zhǎng)，這種蛋白在體內(nèi)的濃度將越來越明顯，尤其是在懷孕后的28 d至33 d，這種蛋白的濃度值達(dá)到高峰。優(yōu)孕凱斯(BioPRYN)是一種使用抗原捕捉(夾心)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)牛只血清中妊娠特異性蛋白 B(PSPB)的早期妊娠診斷技術(shù)。其原理是牛血清中的 PSPB 結(jié)合包被孔中的抗體(兔IgG 免疫血清)，用標(biāo)記結(jié)合的二抗進(jìn)行檢測(cè)，最后通過顏色變化與酶標(biāo)儀讀數(shù)進(jìn)行定量分析。夾心ELISA靈敏度高，特異性強(qiáng)，空懷檢出率高。根據(jù)光明牧業(yè)有限公司旗下牧場(chǎng)近兩年86775頭份奶牛的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其空懷檢出率可達(dá)99.55%。雖然空懷檢出率很高，但依然存在許多問題，采樣時(shí)間，采樣手法以及在實(shí)驗(yàn)過程中操作不當(dāng)?shù)榷伎赡茉斐杉訇?yáng)性的結(jié)果。因此本文主要介紹夾心ELISA在奶牛早期妊娠診斷中的應(yīng)用及操作過程中的注意事項(xiàng)，為降低假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)前處理

1.1 樣品采集 采集配種后28 d至33 d的奶牛尾根靜脈血。采血量應(yīng)控制在3～5 mL，不得少于2 mL，以防劑量不足，錯(cuò)過最佳檢測(cè)時(shí)間。另外，采集完的血樣應(yīng)當(dāng)場(chǎng)貼好標(biāo)簽，注明管號(hào)和牛號(hào)，放入-6℃冷藏保存，尤其夏季溫度較高，在寄送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)前必須放入冰袋以防采集的血液變質(zhì)，送檢單單獨(dú)存放隨樣品一同寄出。

1.2 樣品制備 實(shí)驗(yàn)室收到血樣后，仔細(xì)核對(duì)血樣編號(hào)與送檢單，若出現(xiàn)樣本上的牛號(hào)與送檢單上牛號(hào)不一致，需在送檢單上用紅色水筆注明管上牛號(hào)，實(shí)驗(yàn)室所有檢測(cè)牛號(hào)都以血樣牛號(hào)為準(zhǔn)。確認(rèn)無(wú)誤后將全血采血管放入3000轉(zhuǎn)速的離心機(jī)中離心5 min。取上清液1～1.5 mL到2 mL離心管(離心管由管號(hào)+牛號(hào)組成，與采血管相對(duì)應(yīng))。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與設(shè)備

2.1.1 儀器Thermo FC型號(hào)酶標(biāo)儀(帶有600 nm波長(zhǎng)濾光片)；37 ℃ 或者20 ℃恒溫箱一臺(tái)；

2.1.2 移液器50.0～200.0 μL單槍頭移液器；50.0～300.0 μL多通道移液器；及配套移液槍頭若干；

2.1.3 輔助用品封口膜若干；移液槽5～6個(gè)；吸水紙巾；

2.1.4 試劑美國(guó)“優(yōu)孕凱斯”早孕診斷試劑盒；質(zhì)控劑。

2.2 操作步驟

2.2.1 回溫實(shí)驗(yàn)前回溫(20～25 ℃)所需的試劑盒、微孔板和樣品。使用前需將所用試劑搖勻。

2.2.2 ELSIA板操作 在所有測(cè)試孔中加入樣品緩沖液。其次加入標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品。標(biāo)準(zhǔn)品做重復(fù)樣，按照縱向排列的順序依次加入，第二列開始直至倒數(shù)第二列縱向依次向下加入待檢血清，最后一列留加質(zhì)控樣，對(duì)比每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。每種溶液加樣時(shí)均使用一次性清潔的槍頭，不可二次使用，避免交叉污染造成假陽(yáng)性或者假陰性。加板結(jié)束用封口膜將微孔板密封以防蒸發(fā)，在20℃或37℃的培養(yǎng)箱孵育1 h。1 h孵育后，移去封口膜，洗板4次，在紙巾上拍干，使用多通道的移液器在所有孔中加入200 μL快速檢測(cè)液(QUICK Detector)。用封口膜蓋住板子，在室溫下(20 ℃)孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。1 h后倒出結(jié)合溶液，洗板2次，在紙巾上拍干后每孔中加入200 μL的增強(qiáng)液(Enhancer)。用封口膜蓋住板子，20 ℃下孵育1 h(或者37 ℃孵育30 min)。

若出現(xiàn)加樣顏色不一致，請(qǐng)務(wù)必?fù)Q一把多通道移液槍，這是用槍不規(guī)范造成的移液槍污染，屬人為原因，并非試劑原因。1 h后洗板4 次，加入200 μL TMB底物溶液到每個(gè)孔中。加TMB時(shí)，確保無(wú)菌，以避免剩余試劑污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外TMB易被氧化，所以在使用前務(wù)必要避光保存。15 min孵育結(jié)束后在所有孔中加入終止液，用手輕輕地拍打微孔板的周邊，使其內(nèi)容物均勻的混合在一起。加終止液的順序要與加TMB的順序一樣，保證反應(yīng)時(shí)間的一致性。全部試劑加完后眼觀可以做初步的判斷，藍(lán)色為懷孕，黃色為空懷，而較淺的顏色需要讀OD值才能確定。

2.2.3 讀數(shù)與分析 在加樣后30 min內(nèi)將微孔板放在600 nm左右波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上讀數(shù)。將酶標(biāo)儀讀出OD值數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件COWPIE，輸入牛號(hào)(圖1)，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出R2值。實(shí)驗(yàn)成立的條件是標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值必需大于0.985(圖2)。生成報(bào)告前，選擇正確的Multiplier 系數(shù)：

BioPRYN QK: 大于3 h的樣品孵育，Multiplier系數(shù)

BioPRYN QK: 小于3 h的樣品孵育，Multiplier系數(shù)

此外，標(biāo)準(zhǔn)品W 的OD 值必須大于0.4 才被認(rèn)為有效。

(W的OD值>X的OD值>Y的OD值>Z的OD值)R2≥0.985。

圖1 牛號(hào)輸入反饋圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

根據(jù)曲線，每個(gè)樣品的OD值會(huì)經(jīng)過最小二乘法回歸(LSG)轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果。離群值已經(jīng)過調(diào)整成符合回歸方程的值。轉(zhuǎn)化后的結(jié)果值與已確定的臨界值進(jìn)行比較(參考表1)，將每個(gè)樣品的結(jié)果進(jìn)行歸類。結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)化的BioPRYN來顯示(圖3)。

血液早孕檢測(cè)屬于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，該診斷方法相比B超診斷變異小，影響因素少，不同的實(shí)驗(yàn)操作人員按照操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)，其準(zhǔn)確性都是一致的[3]。所以系統(tǒng)測(cè)出的懷孕與空懷進(jìn)一步與板上的顯色反應(yīng)進(jìn)行核對(duì)，會(huì)發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與顏色是一一對(duì)應(yīng)的。若有不同，肯定是操作不慎造成，需在該牛號(hào)旁邊標(biāo)注，以備下次復(fù)檢待用。

表1 標(biāo)準(zhǔn)化的OD值分類結(jié)果表

圖3 軟件分析后標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果圖3 實(shí)驗(yàn)后處理

實(shí)驗(yàn)完成后，將試劑盒放置冰箱冷藏(4～8 ℃)，切不可放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)貯存，更不能放在陽(yáng)光直射的地方。特別注意的是冬天溫度較低，為避免試劑冰凍影響試劑的正常使用，需將冰箱冷藏的溫度適當(dāng)調(diào)高。另外，每次實(shí)驗(yàn)后都應(yīng)用新潔爾滅按1∶14的比例配制消毒水對(duì)實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)進(jìn)行消毒滅菌。把實(shí)驗(yàn)服放消毒水中浸泡3～4 h，一個(gè)星期浸泡一次，有條件可每日浸泡，這是對(duì)環(huán)境的要求，更是為了檢測(cè)員自身及他人的生命健康。因此，做好各項(xiàng)消毒防范措施是每個(gè)檢測(cè)員應(yīng)盡的職責(zé)。

4 小結(jié)

目前，夾心ELISA在奶牛早期妊娠診斷技術(shù)上已越來越成熟，特別是與傳統(tǒng)B超或直腸檢查相比，顯示出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該項(xiàng)診斷技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，不僅提高了繁殖率，而且也減少了牛只的應(yīng)激，對(duì)空懷牛只的檢出率更是接近于100%。但在采樣和操作環(huán)節(jié)，仍然需要謹(jǐn)慎操作，以防不正當(dāng)?shù)男袨閷?dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性，影響配種時(shí)間。特別是假陰性，后果更是不堪設(shè)想。因此，我們必須利用好這項(xiàng)技術(shù)才能更好的為牧場(chǎng)服務(wù)。