王金華 柯博熙 陳云 張丹紅

血管性癡呆是由各種心、腦血管疾病導(dǎo)致的一種常見的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為認(rèn)知水平的下降[1]。近年來血管性癡呆發(fā)病率逐漸上升，已成為僅次于阿爾茨海默病第二常見的癡呆類型[2]。然而，對于血管性癡呆目前仍沒有特效的治療方法。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）是一種無創(chuàng)的治療方法，其利用磁場影響腦內(nèi)的各種神經(jīng)電生理活動和代謝途徑，目前主要用于神經(jīng)和精神疾病的治療[3-4]。有研究報道了rTMS對于阿爾茨海默病和血管性癡呆認(rèn)知功能方面的改善作用[5-7]。本研究觀察L-rTMS對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響并探討其神經(jīng)保護(hù)的機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 選取雄性健康SPF級SD大鼠45只，體重220～260g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，動物房環(huán)境噪音低于60dB，室溫控制在20～25℃，相對濕度50%～70%，給予大鼠12h光照/12h黑暗交替的環(huán)境，自由獲取食物與飲用水。所有動物操作均嚴(yán)格遵守國際動物保護(hù)與使用指南的相關(guān)規(guī)定。采用隨機數(shù)字表法將45只大鼠分為3組（模型組、治療組、假手術(shù)組），每組15只。模型組和治療組利用雙側(cè)頸總動脈閉塞法（bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）制作血管性癡呆模型，假手術(shù)組給予同樣的麻醉和操作處理，但不進(jìn)行BCCAO操作。治療組大鼠于造模后給予L-rTMS治療，連續(xù)治療14d，假手術(shù)組和模型組大鼠同時給予假刺激處理。

1.2 主要儀器與實驗試劑 水迷宮檢測系統(tǒng)（上海欣軟），經(jīng)顱磁刺激儀（丹麥 Mag Pro30，MagVenture,Farum）；主要試劑：丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，β-actin抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B-細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cysteine aspartic acid protease 3，Caspase-3）抗體。

1.3 大鼠血管性癡呆建模 采用BCCAO，具體操作方法如下：所有大鼠于手術(shù)前12h開始禁食，可進(jìn)水。利用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑發(fā)揮效果后將大鼠固定于操作臺上，消毒后沿頸部正中切開皮膚，顯露大鼠雙側(cè)頸總動脈，分離周圍組織后雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎。術(shù)后縫合皮膚并消毒，將動物放入籠中室溫下自然蘇醒，正常進(jìn)食水。假手術(shù)組大鼠只分離頸總動脈不進(jìn)行結(jié)扎。

1.4 L-rTMS方案 血管性癡呆大鼠造模成功后，將治療組大鼠固定于一個圓柱型塑料管內(nèi)，暴露大鼠頭部，置于MC-B70蝶形線圈下，線圈內(nèi)徑20mm，外徑100mm，4.2T的最大輸出場強。L-rTMS參數(shù)為1.5Hz，1.5T，每個序列300脈沖，連續(xù)刺激3個序列，每個序列之間間隔2min冷卻磁頭。L-rTMS于14:00-17:00進(jìn)行，1次/d，連續(xù)14d。假手術(shù)組和模型組大鼠給予磁頭反面（無磁刺激影響）刺激，以消除聲音對各組大鼠的影響。

1.5 行為學(xué)檢測 采用水迷宮測試檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的差異。本實驗用水迷宮水池壁高為50cm，水深為 40cm，水溫維持在 20～24°C，水池直徑為150cm。在水迷宮的目標(biāo)象限正中心位置放置一直徑為10cm的水下隱性平臺，平臺上表面位于水下1cm處。前5d進(jìn)行定位航行實驗，4次/d，每次從不同入水點放入大鼠。大鼠面朝水池壁放入池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠尋找平臺的時間。若大鼠120s內(nèi)未到達(dá)水下平臺，則將大鼠小心引導(dǎo)至平臺上，并讓其逗留15s，該大鼠逃避潛伏期記錄為120s。第6天，撤去水下平臺，記錄每組大鼠目標(biāo)象限時間。

1.6 海馬MDA、SOD含量及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)量測定 行為學(xué)實驗后，采用隨機數(shù)字表法在每組中選取5只大鼠測定MDA、SOD含量，每組中選取5只大鼠測定Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白，其余5只大鼠不做處理。麻醉后取腦組織，取海馬備用，利用SOD和MDA試劑盒進(jìn)行兩者含量的檢測。采用RIPA裂解液進(jìn)行蛋白裂解，在4°C條件下使用離心機將勻漿離心5min（12 000×g），隨后采用BCA法測定蛋白濃度。取裂解液在室溫下電泳3h，隨后轉(zhuǎn)膜，TTBS處理1h。再與以下抗體相結(jié)合：β-actin抗體（濃度 1∶1 000）、抗 Bax抗體（1∶1 000）、抗 Bcl-2 抗體（1∶1 000）、抗 Caspase-3 抗體（濃度1∶1 000），4°C過夜。洗膜，然后利用二抗于室溫下孵育1h。最后紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白與β-actin的光密度值比值作為其相對蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠造模后與治療后的逃避潛伏期與目標(biāo)象限時間比較 見表1。

由表1可見，3組造模后與治療后的逃避潛伏期與目標(biāo)象限時間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、治療組造模后及治療后的逃避潛伏期均延長，目標(biāo)象限停留時間減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；模型組與治療組造模后上述指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與模型組比較，治療組大鼠治療后逃避潛伏期縮短、目標(biāo)象限時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3組大鼠造模后與治療后的逃避潛伏期與目標(biāo)象限時間比較（s）

2.2 3組大鼠海馬部位MDA和SOD含量比較 見表2。

表2 3組大鼠海馬部位MDA和SOD含量比較

由表2可見，3組大鼠MDA、SOD含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。模型組、治療組大鼠MDA均高于假手術(shù)組，SOD均低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，治療組大鼠MDA降低，SOD升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 3組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達(dá)比較 見表3。

表3 3組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達(dá)比較

由表3可見，3組Bax、Bcl-2、Caspase-3比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。模型組、治療組Bax、Caspase-3均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療組Bax、Caspase-3均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、治療組Bcl-2均低于假手術(shù)組，治療組Bcl-2高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

L-rTMS是一種有效改善認(rèn)知功能且無創(chuàng)的治療方法，其關(guān)鍵特性在于它能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生刺激神經(jīng)元的電場。L-rTMS不僅對線圈直接刺激部位的神經(jīng)回路產(chǎn)生興奮或抑制作用，對大腦其它遠(yuǎn)隔部位也同樣發(fā)揮作用[8-9]。L-rTMS已被廣泛用于研究各種類型腦功能紊亂，如抑郁癥和癡呆[10-11]。L-rTMS不僅在治療神經(jīng)精神疾病方面臨床療效明顯，還能促使這些患者在認(rèn)知行為方面獲得更好的表現(xiàn)，如單詞回憶、言語記憶、聯(lián)想記憶、選擇性注意、語言功能和其他執(zhí)行功能[12]。許多研究表明，認(rèn)知能力的改善可維持至L-rTMS治療后的8周到3個月[13]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過2周的L-rTMS治療后，血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能得到了明顯的改善。

血管性癡呆是老年人群癡呆的第二常見病因，患者的記憶和執(zhí)行功能出現(xiàn)嚴(yán)重受損[14]。高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥和高同型半胱氨酸血癥是血管性癡呆的重要風(fēng)險因素。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化平衡的變化產(chǎn)生的，這種平衡有利于產(chǎn)生氧自由基或活性氧自由基，而非各種抗氧化劑防御機制[15]。氧化應(yīng)激是與腦卒中相關(guān)的神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能障礙的調(diào)節(jié)劑，在大鼠腦梗死灶周圍可發(fā)生氧化DNA損傷[16-18]。氧化應(yīng)激不僅與血管性癡呆有關(guān)，與血管性癡呆的危險因素也相關(guān)。MDA和SOD在很多研究中都被廣泛地用來代表氧化應(yīng)激能力[19-20]。血管性癡呆患者M(jìn)DA含量明顯升高[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管性癡呆大鼠海馬MDA表達(dá)增多、SOD活性降低，說明血管性癡呆大鼠模型出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷，這與之前的研究結(jié)果相一致。L-rTMS治療后MDA和SOD水平發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，證實了L-rTMS治療改善血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能可能與其抗氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。

凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，在細(xì)胞死亡的眾多不同機制中，細(xì)胞凋亡被提出用于解釋許多神經(jīng)障礙中所觀察到的細(xì)胞缺失，如阿爾茨海默病、血管性癡呆、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、腦卒中等等[22]。Bcl-2和Bax是負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個主要基因。Bcl-2是抗凋亡Bcl-2家族的關(guān)鍵成員，其對調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[23-24]。Bcl-2的過度表達(dá)已經(jīng)被證明可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受神經(jīng)毒素的傷害[25]。Bax屬于促生存子家族中的一員，其通過轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而促進(jìn)下游的細(xì)胞凋亡過程[26]。Caspase是一種半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)。Caspase參與凋亡過程主要通過兩種不同的途徑：死亡受體途徑和線粒體途徑。無論涉及何種途徑，Caspase-3都扮演著凋亡執(zhí)行者的作用。Caspase-3是一種促凋亡酶[27-28]，通過激活DNA分裂因子，進(jìn)而激活內(nèi)切酶分裂核DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。凋亡已經(jīng)被證實是與血管性癡呆相關(guān)的重要分子生物學(xué)機制，大量動物實驗也涉及相關(guān)研究[29]。本研究利用免疫印記方法檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)血管性癡呆大鼠海馬Caspase-3和Bax的表達(dá)增多，而Bcl-2降低，同樣證實了血管性癡呆大鼠海馬凋亡途徑的激活。L-rTMS治療組大鼠海馬Caspase-3和Bax的表達(dá)減少，Bcl-2的表達(dá)增多，提示L-rTMS治療在治療血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙過程中發(fā)揮了明顯的抗凋亡特性。

總之，L-rTMS治療可明顯改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能，降低MDA水平，升高SOD的活性，抑制了血管性癡呆大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，其對血管性癡呆大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制可能與抑制缺血損傷后凋亡途徑和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究結(jié)果證實了L-rTMS治療對于血管性癡呆大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，這為血管性癡呆或其它類型癡呆的基礎(chǔ)和臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。但本研究發(fā)現(xiàn)L-rTMS治療未使血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能得到完全改善，也顯示了其治療的局限性，今后我們將會對其機制作進(jìn)一步深入研究。（致謝：感謝河北醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)內(nèi)科、河北省腦老化與認(rèn)知障礙重點實驗室碩士生導(dǎo)師、副主任醫(yī)師王華龍對大鼠造模及水迷宮試驗提供的幫助。）