譚謙 曾肆 童妍

摘要：目的 ?觀察大黃素甲醚對(duì)皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞的影響。方法??體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，皮質(zhì)酮處理后給予大黃素甲醚干預(yù)。采用CCK-8法檢測(cè)皮質(zhì)酮毒性及大黃素甲醚作用于皮質(zhì)酮損傷后PC12細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡;氮藍(lán)四唑還原法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平;Western blot測(cè)定PC12細(xì)胞內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）蛋白表達(dá)。結(jié)果??與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，大黃素甲醚組PC12細(xì)胞活力增強(qiáng)，PC12細(xì)胞凋亡率降低，PC12細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，PC12細(xì)胞內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 ?大黃素甲醚對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大黃素甲醚;PC12細(xì)胞;神經(jīng)毒性;細(xì)胞活力;活性氧;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.010

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2018）10-0040-04

Study on Protective Effects?of Physcion on PC12 Cells?Injured by Corticosterone

TAN Qian，?ZENG Si，?TONG Yan

College of Life Science and Engineering，?Southwest Jiaotong University，?Chengdu?610031，?China

Abstract： Objective?To observe?the effects of physcion on PC12 cells?injured by corticosterone. Methods PC12 cells were cultured in vitro， and the cells were treated with physcion after corticosterone intervention. CCK-8?was used to detect corticosterone toxicity and the?survival rate of PC12 cells injured by corticosterone after treated by physcion. The apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry. The level of intracellular ROS was determined by NBT reduction assay. BDNF protein expression in PC12 cells was detected by Western blot. Results Compared?with the blank group， the viability of PC12 cells in the model group decreased （P<0.01）; Compared with the model group， the viability of PC12 cells increased， apoptosis rate of PC12 cells decreased， ROS content in PC12 cells decreased， and BDNF protein expression in PC12 cells increased in the physcion group. Conclusion?Physcion has protective effects on corticosterone-induced PC12 cellular damage.

Keywords：?physcion; PC12 cells; neurotoxicity; cell viability; ROS; BDNF

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床表現(xiàn)的精神疾病，嚴(yán)重者伴有自殺傾向，發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢(shì)。然而，現(xiàn)今主流的抗抑郁藥物都有很大的局限性，而中醫(yī)治療抑郁癥則由于受眾廣、見效快而備受關(guān)注，近年來相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究也取得了相應(yīng)的進(jìn)展^[1]。大黃素甲醚（physcion）屬蒽醌類化合物，是大黃的主要成分之一?，F(xiàn)代藥理研究顯示，大黃素甲醚具有抗抑郁作用^[2]，對(duì)急性肝、腦損傷具有保護(hù)作用^[3]，還可以抗腫瘤^[4]，能有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡^[5]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，采用體外培養(yǎng)，以皮質(zhì)酮（Cort）損傷PC12細(xì)胞構(gòu)建抑郁癥高皮質(zhì)酮血癥體外模型，探究大黃素甲醚對(duì)抗Cort神經(jīng)毒性的作用及可能的機(jī)制。

1 ?材料與方法

1.1 ?藥物和細(xì)胞株

大黃素甲醚、PC12細(xì)胞，成都里來生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 ?主要試劑與儀器

南美胎牛血清（FB15011），美國(guó)CLARK公司;胰酶（J15003），美國(guó)HyClone公司;RPMI1640培養(yǎng)基（SH30809.01），美國(guó)HyClone公司;雙抗（sv30010），美國(guó)HyClone公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒（BS350B），中國(guó)Biosharp公司;Cort（50-22-6），中國(guó)Meryer公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（KGP903），南京凱基生物公司;預(yù)染蛋白Marker（00215343），美國(guó)NEB公司;ECL發(fā)光試劑盒（BL520A），美國(guó)Thermo公司;PVDF膜，美國(guó)Hybond公司;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）抗體（ab108319），英國(guó)Abcam公司;生物素化山羊抗兔IgG（ab6721），英國(guó)Abcam公司。CO₂培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司），倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司），垂直電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司），DYY-6C電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），凝膠掃描成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司），MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司），TGL-16G-A型高速低溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Image Lab凝膠分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 ?細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37?℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，半保留換液，每2?d傳代1次。

1.4 ?CCK-8法檢測(cè)皮質(zhì)酮毒性

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，接種于96孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×10⁵個(gè)/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使其貼壁。棄上清液，加入含不同濃度Cort的新鮮培養(yǎng)基。Cort濃度分別為0.2、0.4、0.8 mmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL CCK-8，再培養(yǎng)3 h，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

1.5 ?CCK-8法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至3×10⁴/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37?℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育過夜，使其貼壁。設(shè)置對(duì)照組、模型組（Cort濃度分別為0.2、0.4、0.8 mmol/L）、實(shí)驗(yàn)組（大黃素甲醚低、中、高劑量組，濃度分別為2、4、6 μg/mL），各模型組加入相應(yīng)濃度Cort 100 μL造模24 h后，再分別按低、中、高劑量給藥處理24 h。最后每孔加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)3 h，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度。

1.6 ?流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)瓶接種PC12細(xì)胞，按分組予不同濃度（Cort 0.4 mmol/L，Physcion 4 μg/mL，Cort 0.4 mmol/L+Physcion 4 μg/mL）藥物處理24 h后，胰酶消化，離心，棄上清液，PBS吹洗1次，再次離心，棄去PBS，EP管收集細(xì)胞，于4 ℃預(yù)冷的70%乙醇中固定，-20 ℃貯存1～3 d。檢測(cè)時(shí)，用含碘化丙啶染料制成1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，4 ℃避光30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 ?氮藍(lán)四唑還原法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

將PC12細(xì)胞均勻接種到96孔板中，每孔200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待貼壁長(zhǎng)滿70%～80%，按分組給予不同濃度藥物處理，在5%CO₂、37?℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加氮藍(lán)四唑100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，PBS沖洗2次，每孔加入2?mol/L KOH 100 μL及DMSO 100 μL，于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。

1.8 ?Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的蛋白表達(dá)

按實(shí)驗(yàn)分組予不同濃度（Physcion 2、4、6 μg/mL，Cort 0.4 mmol/L，Cort 0.4 mmol/L+Physcion 4 μg/mL）藥物處理后提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST封閉。分別加入BDNF、β-actin一抗，孵育過夜，洗滌后加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）。暗室內(nèi)ECL法檢測(cè)目的條帶，膠片曝光，顯影，以β-actin為內(nèi)參分析結(jié)果。

1.9 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

與空白組比較，經(jīng)Cort處理24 h后PC12細(xì)胞存活率呈濃度依賴性降低（P<0.01），見圖1.

2.2 ?大黃素甲醚對(duì)不同濃度皮質(zhì)酮損傷PC12細(xì)胞活力的影響

與空白組比較，低濃度Cort模型組細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，大黃素甲醚中、高劑量組細(xì)胞活力增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01），見圖2A。與空白組比較，中濃度Cort模型組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，大黃素甲醚中、高劑量組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01），見圖2B。與空白組比較，高濃度Cort模型組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，大黃素甲醚高劑量組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P<0.05），見圖2C。與空白組比較，細(xì)胞活力與Cort呈濃度依賴性降低（P<0.01）;大黃素甲醚中劑量組能改善0.2、0.4 mmol/L Cort損傷后細(xì)胞活力（P<0.05），見圖3。

2.3 ?大黃素甲醚對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

與0 mmol/L Cort比較，Cort可使PC12細(xì)胞凋亡率明顯上升（P<0.01），單用大黃素甲醚對(duì)細(xì)胞凋亡率無顯著影響;與0.4 mmol/L Cort比較，大黃素甲醚預(yù)處理后PC12細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖4。

2.4 ?大黃素甲醚對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性氧水平的影響

與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞ROS水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，大黃素甲醚中、高劑量組PC12細(xì)胞ROS水平顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

2.5 ?大黃素甲醚對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，大黃素甲醚低、中、高劑量組PC12細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），見圖6。與0 mmol/L Cort比較，大黃素甲醚能升高PC12細(xì)胞BNDF的蛋白表達(dá)，Cort能抑制BDNF的蛋白表達(dá)（P<0.01）;與0.4 mmol/L Cort比較，大黃素甲醚預(yù)處理后PC12細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），見圖7。

3 ?討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示，外源性給予大黃素甲醚可改善慢性不可預(yù)見應(yīng)激模型大鼠的抑郁樣行為^[6]。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，其分化后形態(tài)和功能與神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞相似，其細(xì)胞膜上糖皮質(zhì)激素（GC）受體表達(dá)豐富。研究表明，抑郁癥患者下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能亢進(jìn)，其持續(xù)反復(fù)激活會(huì)導(dǎo)致血中GC顯著升高^[7-8]。有研究認(rèn)為，GC水平升高與抑郁癥的嚴(yán)重程度有關(guān)^[9]。而GC在嚙齒類動(dòng)物主要以Cort為主要形式存在。因此，本研究以高濃度Cort損傷PC12細(xì)胞模擬抑郁癥患者GC損傷腦神經(jīng)元狀態(tài)，構(gòu)建抑郁癥高皮質(zhì)酮血癥體外模型，并用大黃素甲醚進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，大黃素甲醚能顯著改善Cort損傷后PC12細(xì)胞的存活率和凋亡率，減輕Cort對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。

Cort神經(jīng)毒性可誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，促使細(xì)胞凋亡^[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高濃度大黃素甲醚可顯著減少PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，是神經(jīng)元維持正常生理功能所必須。有研究認(rèn)為，神經(jīng)可塑性及細(xì)胞再生能力的損傷可能是加重抑郁發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)^[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬、前額葉皮層BDNF水平及外周血清、血漿中BDNF水平均明顯減少^[12]，有研究報(bào)道，高濃度GC會(huì)抑制包括BDNF在內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)^[13]，尤其在海馬區(qū)^[14]。本研究結(jié)果顯示，大黃素甲醚呈劑量依賴性提高PC12細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)，且可顯著拮抗Cort對(duì)PC12細(xì)胞BDNF表達(dá)的抑制作用。

綜上，可推測(cè)由抑郁癥引起的慢性應(yīng)激所導(dǎo)致的抑郁癥患者體內(nèi)HPA軸持續(xù)激活狀態(tài)下，腦內(nèi)高濃度GC會(huì)抑制BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的正常表達(dá)，從而加劇海馬神經(jīng)元的增殖和再生障礙及其損傷后的再修復(fù)功能，最終加劇抑郁癥的病情。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素甲醚可保護(hù)PC12細(xì)胞，上調(diào)PC12細(xì)胞BDNF的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)Cort對(duì)BDNF表達(dá)的抑制效應(yīng)。提示大黃素甲醚抗抑郁效應(yīng)可能與其調(diào)控BDNF表達(dá)有關(guān)，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] YEUNG?W F， CHUNG?K F， NG?K Y， et al. A systematic review on the efficacy， safety and types of Chinese herbal medicine for depression[J]. Journal of Psychiatric Research，2014，57（1）：165-175.

[2] 童妍，郝安輝，李坤倫，等.大黃素甲醚對(duì)抑郁大鼠海馬ERK、cAMP、CaMK的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32（2）：73-76.

[3] 熊興富.中藥大黃主要有效成分藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究， 2014，6（10）：143-146.

[4] 蔡可而，王嚴(yán)飛，陸豫.大黃素甲醚衍生物的合成及抗腫瘤活性的研究[J].化學(xué)試劑，2014，36（4）：313-314，377.

[5] 荔志云，張明，季瑋，等.大黃素甲醚對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2013，18（12）：738-741.

[6] 童妍，金釗，趙煥瑛.大黃素甲醚對(duì)慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（1）：54-57.

[7] KUNUGI?H， HORI?H， NUMAKAWA?T， et al. The hypothalamic-pituitary-?adrenal axis and depressive disorder：recent progress[J]. Japanese Journal of Psychopharmacology，2012，32（4）：203.

[8] KASCKOW?J W， BAKER?D， JR?G T. Corticotropin-releasing hormone in depression and post-traumatic stress disorder[J]. Peptides，?2001，22（5）：845-851.

[9] JOKINEN?J， NORDSTR?M?P. HPA axis hyperactivity and attempted suicide in young adult mood disorder inpatients[J]. Journal of Affective Disorders，2009，116（2）：117-120.

[10] XIONG?Y， REN?L， WANG?Z， et al. Anti-proliferative effect of Physcion on human gastric cell line via inducing ROS-dependent apoptosis[J]. Cell Biochemistry & Biophysics，2015，73（2）：537.

[11] KURITA?M， NISHINO?S， KATO?M， et al. Plasma brain-derived neurotrophic factor levels predict the clinical outcome of depression treatment in a naturalistic study[J]. PLoS?One，2012，?7（6）：e39212.

[12] 李曉照，陳澤奇，胡隨瑜，等.抑郁癥患者血清BDNF水平與相關(guān)因素分析[J].中國(guó)臨床心理學(xué)雜志，2005，13（3）：312-313.

[13] MOLTENI?R， CALABRESE?F， CHOURBAJI?S， et al. Depression-prone mice with reduced glucocorticoid receptor expression display an altered stress-dependent regulation of brain-derived neurotrophic?factor and activity-regulated cytoskeleton-associated protein[J]. Journal of Psychopharmacology，2010，24（4）：595-603.

[14] CHEN?H， LOMB?S?M， LE?M D. Glucocorticoid receptor represses brain-derived neurotrophic factor expression in neuron-like cells[J]. Molecular Brain，2017，10（1）：12.