李 潔，曹吉平，李 莉，趙本琦，鄭卓肇*

(1.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院放射科 清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，2.病理科，北京 102218)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是臨床常見腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死亡率第2位，目前年新發(fā)病例約50%來自中國[1]。近年來，HCC的治療雖已取得明顯進(jìn)展，但腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍為主要致死原因[2]。HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，已有研究[3-5]表明腫瘤病理分級及某些免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)(如CK7、CK19、CD34及Ki-67)與之密切相關(guān)。作為一種新型對比劑，MRI肝膽特異性對比劑可反映HCC病理分級和免疫組織化學(xué)特征，但目前結(jié)論尚不一致[6-8]。本研究將HCC釓貝葡胺(gadobenate dimeglumine， Gd-BOPTA)增強(qiáng)掃描與病理進(jìn)行對照，探討HCC增強(qiáng)肝膽期強(qiáng)化率(contrast enhancement ratio， CER)、SNR和CNR與病理分級和免疫組化標(biāo)志物的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2014年12月—2016年12月間于我院接受Gd-BOPTA增強(qiáng)MR檢查的53例患者，其中男33例、女20例，年齡41～73歲，平均(56.3±7.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①于我院接受肝部分切除術(shù)；②術(shù)后病理診斷為HCC；③術(shù)前、術(shù)后病歷資料齊全，能獲取一般資料、血清學(xué)及病理指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有肝臟手術(shù)史及有創(chuàng)性治療史，如穿刺、化療等；②有心、腎功能不全及其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾??；③圖像偽影嚴(yán)重，影響測量。

1.2儀器與方法 采用GE Discovery MR 750 3.0T MR掃描儀，8通道腹部相控陣線圈。掃描前禁食至少4 h，訓(xùn)練患者于呼氣末屏氣，放置呼吸門控軟管，掃描時以肝臟為定位中心，掃描范圍覆蓋整個肝臟。MR平掃：①屏氣軸位可變?nèi)莘e加速肝臟采集(liver acquisition with volume acceleration flex, LAVA-Flex)序列T1WI，TR 3.7 ms，TE 1.2～2.3 ms，屏氣12～15 s，矩陣260×224，層厚5 mm，F(xiàn)OV 34 cm×34 cm；②呼吸觸發(fā)軸位螺旋槳式序列(periodically rotated overlapping parallel lines with enhanced reconstruction, PROPELLER)脂肪抑制T2WI，TR 4 000 ms，TE 72 ms，矩陣320×320，層厚6 mm，層間距 0.5 mm，F(xiàn)OV 38 cm×38 cm；③DWI，TR 8 500 ms，TE 57 ms，矩陣256×192，層厚6 mm，層間距 0.5 mm，F(xiàn)OV 38 cm×38 cm，b值0、800 s/mm2。增強(qiáng)掃描以高壓注射器經(jīng)肘靜脈注射Gd-BOPTA，劑量 0.2 ml/kg體質(zhì)量，注射流率2 ml/s，注射完畢后立即以20 ml生理鹽水以相同速率沖洗。再以LAVA-Flex序列于動脈期、門靜脈期、平衡期及肝膽期行動態(tài)掃描，掃描時間分別為注射對比劑后25 s、70 s、180 s及120 min[9]。

1.3圖像分析 由同一名具有10年工作經(jīng)驗的放射科醫(yī)師對數(shù)據(jù)進(jìn)行測量。選取平掃和增強(qiáng)后肝膽期LAVA-Flex序列圖像，將圓形或橢圓形ROI置于病灶、非瘤肝實質(zhì)和前腹壁外背景處，測量病灶信號強(qiáng)度(SI病灶)、病灶外肝實質(zhì)信號強(qiáng)度(SI實質(zhì))、背景噪聲信號強(qiáng)度(SI背景)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD背景)，ROI面積均大于1 cm2。測量時盡量保證同一患者平掃和肝膽期的ROI選自同一層面，且大小相同、位置恒定。測量病灶信號強(qiáng)度時，將ROI置于病灶內(nèi)較均質(zhì)區(qū)域，盡量避開大血管和膽管；背景噪聲測量時，將ROI置于前腹壁外相位編碼方向上(圖1A、1B)。

利用肝膽期圖像測量數(shù)據(jù)，計算HCC肝膽期SNR和CNR：SNR=SI病灶/SD背景；CNR=(SI實質(zhì)-SI病灶)/SD背景。結(jié)合肝膽期和平掃圖像測量數(shù)據(jù)，計算HCC肝膽期CER：CER=(SNR肝膽期-SNR平掃)/SNR平掃。

1.4病理分析 于手術(shù)切除后15 min內(nèi)用4%甲醛溶液固定腫瘤標(biāo)本，對石蠟組織標(biāo)本行4 μm連續(xù)貼鄰切片，采用HE染色進(jìn)行病理診斷與分級后行免疫組織化學(xué)染色。

HCC病理分級采用Edmondson-Steiner分級法[10]。Ⅰ級：癌細(xì)胞呈高分化狀態(tài)，胞漿明顯嗜伊紅色，核/質(zhì)比接近正常，核圓規(guī)則，核仁明顯，分裂象少見；Ⅱ級：癌細(xì)胞中度分化，略異形，胞漿中顆粒明顯，核/質(zhì)比增加，核染色深淺不一，核仁明顯，分裂象多見；Ⅲ級：癌細(xì)胞分化較差，核/質(zhì)比更高，核異質(zhì)明顯，胞漿嗜蘇木素，胞核大而不規(guī)則，核仁多而明顯，核分裂象多見；Ⅳ級：癌細(xì)胞分化最差，胞質(zhì)少，核染色質(zhì)濃染，核仁不規(guī)則，細(xì)胞形狀極不規(guī)則。同一病灶同時存在不同級別腫瘤組織時，以占主要優(yōu)勢的級別代表整個病灶的病理級別。

表1 不同病理分級HCC Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR比較(±s)

表1 不同病理分級HCC Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR比較(±s)

病理Edmondson-Steiner分級CERSNRCNRⅠ級(n=11)0.60±0.4159.04±21.7019.47±17.86Ⅱ級(n=27)0.49±0.3755.73±24.0026.35±11.89Ⅲ級(n=15)0.30±0.1653.53±26.7230.94±11.96F值2.7860.1631.437P值0.0710.8500.247

圖1 患者男，52歲，術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌(Edmondson-Steiner Ⅱ級) A.平掃LAVA-Flex序列圖像； B.增強(qiáng)肝膽期LAVA-Flex序列圖像； C～F.病理圖(免疫組織化學(xué)染色，×40)，分別為CK7陽性、CK19陽性、CD34陽性及Ki-67陽性HCC (1：測量病灶信號強(qiáng)度的ROI；2：測量病灶外肝實質(zhì)信號強(qiáng)度的ROI；3：測量背景噪聲信號強(qiáng)度及標(biāo)準(zhǔn)差的ROI)

免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)進(jìn)行CK7、CK19、CD34及Ki-67染色。采用以下標(biāo)準(zhǔn)判定染色結(jié)果：CK7陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿呈棕黃色染色；CK19陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿呈棕黃色染色；血管內(nèi)皮細(xì)胞膜染成棕色即為CD34陽性染色；Ki-67陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色染色(圖1C～1E)。出現(xiàn)陽性細(xì)胞即為標(biāo)志物表達(dá)陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料用±s表示，以單因素方差分析比較HCC不同病理級別間肝膽期CER、SNR和CNR的差異；以獨(dú)立樣本t檢驗比較免疫組織化學(xué)標(biāo)志物陽性組與陰性組間HCC肝膽期CER、SNR和CNR的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

53例患者HCC病灶均為單發(fā)，最大徑為0.95～16.09 cm，平均(4.75±3.50)cm；Child-Pugh肝功能分級A級44例，B級9例。術(shù)后病理分果顯示，Edmondson-Steiner Ⅰ級11例、Ⅱ級27例、Ⅲ級15例，無Ⅳ級患者。

不同病理分級HCC間， Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，表1)。隨著HCC病理分級升高，肝膽期CER和SNR呈下降趨勢，CNR則呈增加趨勢。

CK19陽性組與陰性組、CD34陽性組與陰性組HCC之間Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，SNR和CNR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；CK7和Ki-67陽性組與陰性組HCC之間肝膽期CER、SNR和CNR差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，表2)。

3 討論

Gd-BOPTA是釓螯合物類肝膽特異性對比劑，具有較高親脂性，能被有功能的肝細(xì)胞攝取，并經(jīng)膽道排泄。理論上，分化較好的HCC病灶內(nèi)功能性肝細(xì)胞含量較高，可攝取肝膽特異性對比劑，而分化較差的HCC病灶內(nèi)功能性肝細(xì)胞減少或缺失， Gd-BOPTA增強(qiáng)肝膽期表現(xiàn)為病灶強(qiáng)化程度減低，與周圍肝實質(zhì)的對比增加[6-7，11]。本研究不同病理分級HCC之間Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，提示肝膽期CER、SNR抑或CNR均不能用于分級診斷HCC。分析其原因：①HCC病灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞的分化程度不盡相同，Edmondson-Steiner病理分級法選擇占主要優(yōu)勢的級別代表整個HCC病灶的病理級別，不同病理級別HCC病灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞構(gòu)成有一定程度的重疊；②受不同病理級別HCC樣本量限制，未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。但本研究結(jié)果顯示，隨著HCC病理級別升高，肝膽期CER和SNR呈現(xiàn)出減低趨勢，而肝膽期CNR表現(xiàn)出增加趨勢。今后工作中可考慮改良病理分級方法或擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步觀察影像學(xué)指標(biāo)對HCC病理分級的提示作用。

表2 不同免疫組織化學(xué)標(biāo)志物表達(dá)間HCC Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR比較(±s)

表2 不同免疫組織化學(xué)標(biāo)志物表達(dá)間HCC Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR比較(±s)

組別CERSNRCNRCK7 陽性(n=14)0.36±0.2854.93±26.1929.94±18.94 陰性(n=39)0.49±0.3656.10±23.4824.89±11.21 t值1.1230.155-1.190 P值0.2670.8770.239CK19 陽性(n=20)0.32±0.2053.51±22.3527.31±15.27 陰性(n=33)0.55±0.4057.54±25.3825.39±12.49 t值2.6230.603-0.503 P值0.0120.5490.617CD34 陽性(n=37)0.33±0.2055.35±22.8526.62±11.52 陰性(n=16)0.74±0.4356.83±27.1425.32±18.09 t值3.6280.191-0.314 P值0.0020.8500.755Ki-67 陽性(n=31)0.43±0.3651.44±25.9528.60±15.36 陰性(n=22)0.51±0.3262.99±18.7322.31±9.35 t值0.8141.733-1.654 P值0.4200.0890.104

本研究結(jié)果顯示，與陰性組比較，CK19陽性組及CD34陽性組HCC肝膽期CER較小，即強(qiáng)化程度減低，提示HCC低強(qiáng)化的特點可能與CK19、CD34的表達(dá)及預(yù)后不良相關(guān)。臨床研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，CK19陽性HCC腫瘤細(xì)胞具有膽管細(xì)胞癌的分化特征，腫瘤細(xì)胞的侵襲性和繁殖能力更強(qiáng)，惡性程度更高，可以作為預(yù)測肝細(xì)胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素；且腫瘤細(xì)胞CD34表達(dá)陽性提示肝血竇內(nèi)皮化，當(dāng)腫瘤內(nèi)CD34高表達(dá)時惡性程度高，易出現(xiàn)浸潤、轉(zhuǎn)移，術(shù)后復(fù)發(fā)率亦增高。Yoneda等[14]觀察HCC腫瘤細(xì)胞攝取肝膽特異性對比劑的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase， GS)及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporter polypeptides， OATP)相關(guān)，因此推測CK19或CD34可能對GS和/或OATP的表達(dá)有一定抑制作用，從而使腫瘤細(xì)胞對肝膽特異型對比劑的攝取減少，但其確切分子學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究以肝膽期CER、SNR和CNR 3個指標(biāo)與病理結(jié)果對照，但結(jié)果提示僅HCC肝膽期CER在不同免疫組織化學(xué)指標(biāo)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而肝膽期SNR和CNR的價值有限。肝膽期CER通過比較Gd-BOPTA增強(qiáng)前后SNR的變化率來反映HCC病灶的強(qiáng)化程度，與單純信號強(qiáng)度比較，CER降低了背景噪聲、序列參數(shù)選擇等因素的影響，準(zhǔn)確性及可重復(fù)性更高。肝膽期CNR是通過對比HCC病灶與周圍肝實質(zhì)的信號強(qiáng)度差異來反映其強(qiáng)化程度，因此受到肝功能對肝實質(zhì)信號強(qiáng)度的影響[11]，這可能是造成本組肝膽期CNR結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義的原因。

本研究的局限性：①納入病例均為肝功能A級或B級患者，因此結(jié)果不適用于肝功能嚴(yán)重?fù)p害者；②回顧性研究本身帶來的不足，如大量病例在篩選過程中被排除，可能會造成樣本選擇偏差，在今后工作中應(yīng)開展多中心前瞻性研究，進(jìn)一步加以證實。

綜上所述，CK19陽性組及CD34陽性組HCC的肝膽期CER較陰性組顯著減低，提示Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER與CK19或CD34陽性表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)，肝膽期CER越低越傾向于不良預(yù)后；但HCC Gd-BOPTA增強(qiáng)MRI肝膽期CER、SNR和CNR尚不能可靠區(qū)分HCC的病理級別。