郭天芬，林俊芳,2，郭麗瓊,2，葉志偉,2，魏韜,2，許之恒

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系,食品生物技術(shù)研究所,廣東廣州 510642）

（2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642）

血清中高濃度的膽固醇是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素[1]，控制血清膽固醇水平已經(jīng)受到越來越廣泛的關(guān)注。傳統(tǒng)藥物治療存在藥費昂貴，毒副作用較大、治療效果不明顯等缺陷[2]。Mathara等[3]從傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離出了23株乳酸菌，分析顯示部分乳桿菌具有降膽固醇的能力。益生菌對降膽固醇的治療效果明顯，對高血脂的防治有積極作用，并有望替代藥物治療法成為了更安全、更有效的降膽固醇方法[4,5]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是具有降膽固醇[6]、改善免疫功能[7]，維持腸道菌群平衡[8]，抑制腫瘤細(xì)胞的形成[9]等益生功能的革蘭氏陽性細(xì)菌。目前，植物乳桿菌降膽固醇的作用機理主要有以下幾種觀點：（1）細(xì)胞直接吸收膽固醇；（2）膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）作用；（3）胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）的吸附作用；（4）鑒于植物乳桿菌降低膽固醇效果受多種因素的影響，還存在一些其他理論[10]。

植物乳桿菌的次級代謝產(chǎn)物EPS種類繁多，其組分包括果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖等。L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶（L-rhamnulose-1-phosphate aldolase，RhaD）按照供體專一性進行分類，屬于磷酸二羥基丙酮（DHAP）依賴性醛縮酶，在植物乳桿菌中參與L-鼠李糖的代謝。首先，L-鼠李糖在L-鼠李糖異構(gòu)酶的催化下生成L-鼠李樹膠糖，然后經(jīng)過L-鼠李樹膠糖激酶的作用生成L-鼠李樹膠糖-1-磷酸，最后經(jīng)RhaD裂解為L-乳醛和磷酸甘油酮，進入糖酵解循環(huán)[11,12]。研究組前期的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，在植物乳桿菌Lp10菌株降膽固醇過程中rhaD基因表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，推測植物乳桿菌在添加膽固醇環(huán)境下主要是通過產(chǎn)生EPS對膽固醇進行吸附，而此過程中植物乳桿菌為提高EPS的合成量以下調(diào)rhaD基因的表達(dá)量來抑制了L-鼠李糖的代謝。為了深入分析rhaD基因與植物乳桿菌Lp10菌株降膽固醇功能的關(guān)系，本研究利用同源重組原理敲除rhaD基因，并比較初始菌株與突變菌株的降膽固醇能力。同源重組技術(shù)在乳酸菌中已經(jīng)應(yīng)用廣泛，例如李婭妮等[13]在pUC18敲除載體的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了基因敲除載體pUC18△lai并實現(xiàn)對植物乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶（Linoleic isomerase，lai）基因的敲除；岳云春等[14]利用同源重組法構(gòu)建質(zhì)粒pKLKRT，并電轉(zhuǎn)化于副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建組氨酸蛋白激酶基因缺失突變株。

植物乳桿菌Lp10菌株是本研究組前期從海帶中分離出來的一株具有高降膽固醇能力的乳酸菌[15]。本實驗選用pNZ5319作為敲除質(zhì)粒，構(gòu)建rhaD基因敲除載體，試圖摸索出一套完整的植物乳桿菌基因敲除載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化體系，為植物乳桿菌降膽固醇機制及其功能基因的分析研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Lp10菌株由本研究組從海帶中分離純化并保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購買于大連TaKaRa公司；質(zhì)粒pNZ5319由南開大學(xué)喬明強教授惠贈。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購買于TIANGEN公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購買于MAGEN公司；Ex Taq酶購買于大連Takara公司；限制性內(nèi)切酶XhoI、PmeI、SacI、BglII購買于 Thermo Fisher Scientific公司；氯霉素（chloramphenicol，cm）購于Solarbio公司；其余試劑均為分析純。

MRS培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、pH 6.8、瓊脂20 g（固體培養(yǎng)基添加）。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、pH 7.0、瓊脂粉 20 g（固體培養(yǎng)基添加）。

恢復(fù)培養(yǎng)基：含0.3 mol/L蔗糖、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2的MRS培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器

SPX-158L生化培養(yǎng)箱寧波新芝生物科技股份有限公司；FRESC21微量臺式冷凍離心機Thermo Fisher Scientific公司；YXQ50蒸汽滅菌鍋西安太康生物科技公司；BIO-RADC1000梯度PCR儀和Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD公司；SKJH-1109超凈工作臺上海蘇坤實業(yè)公司；EPS-300電泳儀上海天能公司。

1.1.4 引物

本文所用引物如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1rhaD基因同源臂的克隆及純化

根據(jù)GenBank中已登錄的植物乳桿菌rhaD基因兩側(cè)序列，設(shè)計引物rhaD-up-F/rhaD-up-R、rhaD-down-F/rhaD-down-R分別擴增長約為 1200 bp的rhaD基因上游同源臂（rhaD-up）和下游同源臂（rhaD-down），并在rhaD-up片段引入限制性酶切位點XhoI和PmeI，rhaD-down片段引入限制性酶切位點SacI、BglII。植物乳桿菌Lp10菌株基因組DNA按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA（225 ng/μL）2 μL，10×Ex Taq buffer（20 mM）5 μL，dNTPs（2.5 mM）4 μL，上下游引物（20 μM）各1 μL，Ex Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 補足 50 μL。PCR 條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，65 ℃（rhaD-up）或68 ℃（rhaD-down）退火30 s，72 ℃延伸72 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶并使用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收目的片段并進行測序比對分析。

1.2.2rhaD基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 敲除載體pNZ5319-rhaD構(gòu)建路線Fig.1 Structure route of knockout vector pNZ5319-rhaD

植物乳桿菌rhaD基因的pNZ5319-rhaD敲除質(zhì)粒的構(gòu)建路線如圖1所示。利用限制性內(nèi)切酶XhoI和PmeI分別對pNZ5319質(zhì)粒和rhaD-up進行雙酶切并進行瓊脂糖電泳回收，利用abm必克隆試劑盒將雙酶切處理后的pNZ5319質(zhì)粒和rhaD-up片段進行連接處理，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并于終濃度為15 μL/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。

挑取轉(zhuǎn)化子并擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進行XhoI和PmeI雙酶切鑒定和測序鑒定，將正確的重組質(zhì)粒命名為pNZ5319-up。

分別將 pNZ5319-up質(zhì)粒和下游同源臂rhaD-down片段進行SacI和BglII雙酶切和回收處理。將雙酶切后的pNZ5319-up質(zhì)粒和rhaD-down片段連接并轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序鑒定（參照1.2.2.1），將正確的重組質(zhì)粒命名為pNZ5319-rhaD。

1.2.3 植物乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

植物乳桿菌 Lp10菌株按 1%接種量接種于 100 mL含1%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基，37 ℃，靜置培養(yǎng)至OD600約0.8（6～7 h）；冰浴15 min，使菌停止生長；于4 ℃，8000 g下離心5 min后收集菌體；用100 mL冰浴的30% PEG4000洗滌3次，離心條件同上；用1 mL冰浴的30% PEG4000重懸菌體，分裝每管100 μL，-80 ℃保存。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化

將20 μL 重組質(zhì)粒（濃度537.8 ng/μL）與100 μL植物乳桿菌 Lp 10菌株感受態(tài)細(xì)胞在冰浴條件下混勻，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，冰浴10 min。在電阻200 Ω，電容值25 μF，電壓2.5 kV條件下進行電擊，電擊后迅速加入800 μL恢復(fù)培養(yǎng)基，混合均勻后37 ℃靜置培養(yǎng)3 h并涂布于含終濃度為5 μg/mg氯霉素的MRS培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.5 植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株的鑒定

利用TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱）提取植物乳桿菌 Lp10初始菌株和重組轉(zhuǎn)化子的基因組 DNA。以重組轉(zhuǎn)化子和初始菌株基因組DNA為模板，分別擴增上游同源臂rhaD-up、下游同源臂rhaD-down、cm基因和rhaD基因等DNA片段。

1.2.6 植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株的生長分析

將植物乳桿菌突變株與初始菌株按接種量 1%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，以0 h為起點，每隔2 h取一次樣并測定OD600，測定到24 h，通過軟件Origin繪制生長曲線，觀察兩株菌的生長情況。

1.2.7 植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株的降膽固醇能力測定

將植物乳桿菌突變株與初始菌株分別接種于加有1%膽固醇溶液的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h。

按照鄰苯二甲醛法[15]對初始菌株和突變菌株進行降膽固醇能力的測定，每個樣品進行3次重復(fù)進行試驗。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中每個數(shù)據(jù)重復(fù)三次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 8.5軟件作圖，SPSS 17.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1rhaD基因同源臂的克隆及純化

以植物乳桿菌Lp10菌株基因組DNA為模板，分別擴增rhaD基因上下游同源臂，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在1200 bp處都有明顯的單一條帶，與預(yù)計大小一致（圖2）。目的條帶的測序鑒定表明rhaD基因上下游同源臂被成功克隆。

圖2 rhaD基因同源臂的PCR擴增Fig.2 PCR amplification for homologous arms of rhaD gene

2.2 同源臂與pNZ5319載體的連接及轉(zhuǎn)化

對上游同源臂rhaD-up片段與敲除載體pNZ5319連接所得的pNZ5319-up轉(zhuǎn)化子進行菌液PCR鑒定及XhoI和PmeI雙酶切鑒定。PCR凝膠電泳結(jié)果顯示在1200 bp處有一清晰條帶，與目的片段rhaD-up大小相符（圖3a）；雙酶切pNZ5319-up質(zhì)粒，得到2個片段，大小與pNZ5319質(zhì)粒和rhaD-up相符（圖3b）。同理，得到的 pNZ5319-rhaD轉(zhuǎn)化子進行菌液 PCR鑒定及SacI和BglII雙酶切鑒定（圖3c和3d）。DNA測序結(jié)果進一步驗證敲除載體 pNZ5319-rhaD被成功構(gòu)建。

圖3 敲除載體轉(zhuǎn)化子的鑒定Fig.3 Identification of transformants with knockout vector

2.3 重組轉(zhuǎn)化子的鑒定

利用引物rhaD-up/rhaD-down、cm-up/cm-down對植物乳桿菌初始菌株和重組轉(zhuǎn)化株進行PCR鑒定。實驗結(jié)果顯示，從植物乳桿菌 Lp10初始菌株基因組DNA中能擴增到與目的基因rhaD（852 bp）大小相同的片段，而不能從重組轉(zhuǎn)化株的基因組 DNA和ddH2O（陰性對照）中擴增出相同的片段（圖 4b）；從重組轉(zhuǎn)化株基因組DNA中能擴增出與目的基因cm（651 bp）大小相同的片段，而不能從初始菌株基因組DNA和ddH2O中擴增出相同片段（圖4c）。分別將以上擴增所得的兩個片段進行回收和測序鑒定，表明兩者分別為rhaD和cm基因。因此，重組轉(zhuǎn)化株的rhaD基因被成功敲除。

圖4 植物乳桿菌Lp10重組轉(zhuǎn)化株的鑒定Fig.4 Identification of recombinant transformation of L.plantarumLp10

2.4 植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株的生長曲線

圖5 突變菌株和初始菌株的生長曲線Fig.5 growth curve of mutant strain and original strain

植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株與初始菌株在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線如圖5，兩株菌都符合典型的生長曲線趨勢，在4 h進入對數(shù)生長期，14 h后進入穩(wěn)定生長期，但突變株進入穩(wěn)定生長期后相比于初始菌株生長稍緩慢。

2.5 植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株的降膽固醇能力

圖6 膽固醇能力的測定Fig.6 Determination of cholesterol lowering ability

根據(jù)鄰苯二甲醛法測定膽固醇降解率，據(jù)圖6可知，初始菌株的膽固醇降解率為45%，突變菌株的膽固醇降解率為41%，兩株菌株的 OD600分別為2.373和 2.133，即初始菌株的膽固醇降解率為18.96%/OD600，敲除菌株的膽固醇降解率為19.22%/OD600，結(jié)果表明基因rhaD敲除后，植物乳桿菌 Lp10的降膽固醇能力略有上升，但差異不顯著（p＞0.05）。

3 結(jié)論

3.1 近年來，利用組學(xué)研究挖掘差異基因已經(jīng)成為趨勢，例如基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白組學(xué)等，了解差異基因的功能已成為研究的熱點和核心內(nèi)容。研究基因功能的一個重要方法，就是對該基因進行敲除，獲得突變株，然后根據(jù)突變株的變化來推測基因產(chǎn)物的功能[17]。本研究基于植物乳桿菌Lp10降膽固醇過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過GO數(shù)據(jù)庫和KEGG代謝通路數(shù)據(jù)分析，選擇rhaD基因為研究對象。利用同源重組原理，成功獲得植物乳桿菌Lp10rhaD基因敲除突變株。對初始菌株與敲除菌株進行生長曲線及降膽固醇能力測定，結(jié)果表明，敲除菌株的生長較初始菌株更緩慢，初始菌株的膽固醇降解率為18.96%/OD600，敲除菌株的膽固醇降解率為19.22%/OD600，表明基因rhaD基因經(jīng)敲除后，植物乳桿菌 Lp10的降膽固醇能力略有上升，但差異不顯著，推測可能原因是敲除載體pNZ5319-rhaD在植物乳桿菌Lp10發(fā)生同源重組時，cm抗性基因與rhaD基因發(fā)生互換，cm基因整合到基因組上，對植物乳桿菌 Lp10生長、生理活動等產(chǎn)生負(fù)影響，后續(xù)研究可將Cre-loxP系統(tǒng)[14]轉(zhuǎn)化至突變株中，對抗性篩選標(biāo)記cm基因進行敲除，此外，rhaD基因的敲除對菌體生長也有所影響，該基因參與鼠李糖在生物體內(nèi)的代謝，且鼠李糖屬于細(xì)胞初級代謝產(chǎn)物，rhaD基因的敲除影響菌體細(xì)胞正常的初級代謝，從而導(dǎo)致菌體生長減緩，菌體量下降。

3.2 本研究構(gòu)建pNZ5319-rhaD敲除載體時，考慮同源重組效率與同源臂長度有一定的關(guān)系，在0.3～1.2 kb范圍內(nèi)，隨著同源臂長度的增加，同源重組效率呈對數(shù)增加[14]，rhaD基因的上下游同源臂rhaD-up/rhaD-down長度都約為1200 bp，有利于目標(biāo)基因與抗性篩選基因發(fā)生同源重組。本研究選用的載體pNZ5319是植物乳桿菌-大腸桿菌穿梭載體，氯霉素抗性篩選標(biāo)記在植物乳桿菌和大腸桿菌中都能發(fā)揮作用，無需其他抗性基因的引入，簡化了實驗操作。

3.3 近年來，隨著分子生物學(xué)的大力發(fā)展，基因敲除技術(shù)成為了熱點。同源重組技術(shù)已成功應(yīng)用于乳酸菌中，但存在效率低、工作量大等缺點，通過合理設(shè)計同源臂、選擇合適的敲除載體、優(yōu)化電擊條件均可以提高同源重組效率。除了傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)，CRISPR/Cas技術(shù)已日漸成熟[18,19]。Jiang等[20]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)成功實現(xiàn)了原核生物基因的定向修飾。后續(xù)研究可嘗試?yán)肅RISPR/Cas技術(shù)建立和完善的植物乳桿菌基因操作系統(tǒng)。

3.4 植物乳桿菌敲除系統(tǒng)可以用于降膽固醇功能性植物乳桿菌的開發(fā)，應(yīng)用于酸奶、乳酸菌飲料及益生菌制劑等方面達(dá)到降膽固醇的目的，彌補藥物治療引發(fā)的肝腎受損、戒斷反應(yīng)和復(fù)發(fā)等副作用，減少心腦血管發(fā)病率，并且食品級敲除菌株包括獨特風(fēng)味，成本低，效率高等優(yōu)點，具有一定的市場前景。

3.5 本研究成功建立了一套完整的植物乳桿菌敲除體系及電轉(zhuǎn)化體系，這不僅為植物乳桿菌基因敲除載體的構(gòu)建提供了一定的實驗經(jīng)驗，也為后續(xù) rhaD基因的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。為了進一步深入驗證rhaD基因與EPS吸附作用降膽固醇機制的關(guān)系，后續(xù)研究將對敲除前后菌體表面的EPS含量及種類進行分析鑒定，為高效降膽固醇乳酸菌制劑的研究和開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。