王敬偉， 張永威， 李新霞， 李琳琳， 王 燁， 駱 新， 王麗鳳， 毛新民,3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 3中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

隨著全球人口的老齡化、人們生活方式及習(xí)慣的改變，血栓性疾病已成為影響人類健康的重大問題[1]。昆侖雪菊(CoreopsistinctoriaNuff.)學(xué)名兩色金雞菊，為菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)1年生草本植物[2]。兩色金雞菊頭狀花序中富含黃酮類成分，其中主要成分為查爾酮類和二氫黃酮類[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明兩色金雞菊具有抗糖尿病[4]、抗凝血[5]、降壓[6]、降脂[7]等活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)兩色金雞菊提取物可以延長小鼠的凝血時間和出血時間[8]。有研究表明查爾酮化合物對由花生四烯酸和膠原蛋白引起的兔血小板的聚集有良好的抑制[9]。本研究采用硅膠柱層析法分離得到兩色金雞菊中的奧卡寧，采用紅外、質(zhì)譜、核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并對其抗血小板聚集作用進(jìn)行探索，現(xiàn)報道如下。

1 儀器和試藥

1.1儀器LC-20AB型高效液相色譜儀(日本島津公司)，490-4D型血小板聚集儀(美國 Chrono-log公司)，BC-2300型準(zhǔn)全自動三分群血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，中低壓制備色譜(瑞士BUCHI公司)，CAMAG REPROSTAR3薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)，硅膠G高效板(青島海洋化工廠)，IR-Prestige紅外光譜儀(日本島津公司)，ACQUITY○RTQD質(zhì)譜儀(美國 Waters公司)，Inova 600型核磁共振光譜分析儀(美國 Varian公司)。

1.2試藥兩色金雞菊醇提物由新疆醫(yī)科大學(xué)藥理教研室自制(批號 20150526)，2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(美國 Sigma 公司，批號 D9754)，200～300目硅膠(青島海洋化工廠，批號 3180216)，二磷酸腺苷(美國 Sigma公司，A2754)，凝血酶(美國 Sigma公司，批號 T6884)，阿司匹林(美國 Sigma公司，批號 A2093)。

2 方法與結(jié)果

2.1奧卡寧的制備兩色金雞菊干燥花序粉碎，乙醇回流提取，減壓濃縮、干燥得到ETE。取適量ETE溶于的水，然后用正己烷和乙酸乙酯(1∶1)萃取，減壓濃縮后制成浸膏，硅膠柱層析，干法上樣。以二氯甲烷和甲醇(9∶1～5∶5)進(jìn)行梯度洗脫，并收集洗脫液。通過TLC分析方法對各管洗脫液進(jìn)行追蹤分析，將相似組分合并后進(jìn)行旋蒸得到奧卡寧結(jié)晶，經(jīng)重結(jié)晶后得到純度為97.4%的奧卡寧結(jié)晶。

2.2奧卡寧的純度測定及結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 奧卡寧HPLC分析 稱取適量奧卡寧，加甲醇溶解，制成樣品溶液供測試用。HPLC分析條件：Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A：0.5%甲酸水，流動相B：乙腈，以30%的乙腈進(jìn)行等度洗脫，采用面積歸一化法，測定奧卡寧的純度為97.4%。

2.2.2 奧卡寧紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法，于紅外光譜儀掃描得紅外吸收光譜。根據(jù)紅外圖譜可知3 388 cm-1與-OH的伸縮振動相符，表明結(jié)構(gòu)中含有-OH；2 922 cm-1與C=C的伸縮振動相符，表明結(jié)構(gòu)中含有C=C；1 637 cm-1與C=O的伸縮振動相符，表明結(jié)構(gòu)中含有C=O；1 560～1 500 cm-1與苯環(huán)的伸縮振動相符，表明結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)。本品的IR吸收光譜特征與奧卡寧結(jié)構(gòu)相符，見圖1、2。

圖1 奧卡寧結(jié)構(gòu)式

圖2 奧卡寧紅外吸收光譜圖

2.2.3 奧卡寧質(zhì)譜分析 稱取奧卡寧，加甲醇溶解，制成樣品溶液供測試用，分別測定供試品的一級和二級質(zhì)譜圖。質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子化(ESI-)，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔氣壓40 V，源溫度120℃，脫溶溫度350℃，氬氣流速50 L/h，氮?dú)饬魉?50 L/h。結(jié)果表明，質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～300，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z=287，提示分子量為288，與奧卡寧結(jié)構(gòu)吻合；二級質(zhì)譜的主要離子為287，151，135，按奧卡寧的結(jié)構(gòu)對其碎片進(jìn)行歸屬，能得到合理的解釋，見圖3。

圖3 奧卡寧裂解示意圖

2.2.4 核磁共振氫譜 取適量奧卡寧溶于氘代甲醇(CD3OD，99.9%)中供測試用，測定奧卡寧的1H-NMR。結(jié)果表明，1H NMR(600 MHz，CD3OD)在δ7.63(1H，d，J=15Hz，β-H)和δ7.45(1H，d，J=15.6Hz，α-H)處提示分子中含有不飽和的烯烴質(zhì)子，δ7.44(1H，d，J=6.6Hz，H-6′)和δ6.38(1H，d，J=9Hz，H-5′)、δ7.09(1H，d，J=1.8Hz，H-2)、δ7.01(1H，d-d，J=1.8，8.4Hz，H-6)、δ6.73(1H，d，J=7.8Hz，H-5)分別為苯環(huán)上的氫。1H-NMR(CD3OD)譜表明，除去活潑氫共振峰外，分子結(jié)構(gòu)中共有7種不同環(huán)境的7個質(zhì)子的共振峰，與奧卡寧的分子結(jié)構(gòu)中氫原子組成相符。由此，對奧卡寧中的氫的化學(xué)位移均進(jìn)行了合理的歸屬。并且以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道一致，故鑒定為奧卡寧。

2.3ETE、奧卡寧對血小板聚集的影響

2.3.1 血漿樣品的制備 采集靜脈血，血液以3.8%枸櫞酸鈉抗凝(9∶1)。血漿先以1 200 r/min離心10 min，吸取上層富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)，剩余血液3 000 r/min，離心15 min，吸取上清液為貧血小板血漿(Platelet-poor plasma，PPP)，用PPP調(diào)整PRP中的血小板個數(shù)為2×1011～3×1011個/L。

表1 ETE及奧卡寧體外對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響

注：與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

2.3.3 ETE、奧卡寧體外對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的影響 取PRP隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)、ETE高(900 μg/mL)、中(300 μg/mL)、低(100 μg/mL)劑量組、奧卡寧高(45 μg/mL)、中(15 μg/mL)、低(5 μg/mL)劑量組、ASA組(500 μg/mL)。用490-4D血小板凝聚儀測定各組血小板聚集率。按照Born比濁法，在比色杯中分別加入PPP和PRP，同時加入30 μL供試液，在37℃下孵育5 min，再加入20 μL凝血酶，測定血小板聚集率，記錄5 min內(nèi)最大聚集率。血小板抑制率=(對照組抑制率-藥物組抑制率)/對照組抑制率×100%。與對照組相比， ETE中劑量組能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ETE高劑量組能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；奧卡寧中劑量組能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，奧卡寧高劑量組能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 ETE及奧卡寧體外對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的影響

注：與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

當(dāng)血管破裂發(fā)生出血時，人體生理上會產(chǎn)生血管收縮、血小板聚集和血液凝固3個過程的生理性止血。多種凝血、抗凝和纖溶因子的質(zhì)或量的變化，血管的結(jié)構(gòu)或功能出現(xiàn)異常，以及血細(xì)胞，尤其是血小板的質(zhì)或量異常，都會導(dǎo)致出血或血栓形成性疾病[11]。對于血栓形成的防治，可從降低血小板功能、保護(hù)血管內(nèi)皮、促進(jìn)纖溶活性、抑制血液凝固、降低血液黏滯性、改善血流動力與流態(tài)條件等方面采取措施[12]。本實驗選擇降低血小板功能這一途徑進(jìn)行研究。血小板活化途徑主要有凝血酶、ADP、膠原、腎上腺素、血栓素A2、血小板活化因子等。其中ADP途徑降低血小板中的cAMP的水平[13]，并能刺激血小板顆粒釋放分泌TXA2[14]，激活纖維蛋白原受體，誘發(fā)血小板聚集。凝血酶是一種專一性很強(qiáng)的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，可以由無活性的凝血酶原轉(zhuǎn)化而來。凝血酶可以直接作用于血液中的纖維蛋白原，催化其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，促進(jìn)血液凝塊形成[15]。

綜上所述，本研究對兩色金雞菊醇提物進(jìn)行分離純化得到一個單體查爾酮化合物，并通過紅外、質(zhì)譜、核磁鑒定其為奧卡寧。體外抗血小板聚集實驗結(jié)果提示，兩色金雞菊醇提物和奧卡寧可以不同程度的抑制ADP和凝血酶引起的健康志愿者血小板聚集，并且表明兩色金雞菊醇提物抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集時，奧卡寧為主要的活性物質(zhì)，但奧卡寧抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。