袁白銀 劉鐘穎

（武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，武漢 430065）

先天性心臟缺陷是人類死亡率最高的疾病之一，影響約 1% 的新生兒［1］。30% 的人類先天性心臟缺陷是由流出道（Outflow tract，OFT）發(fā)育異常引起的［2-3］。OFT 和右室（Right ventricle，RV）是由第二心場(chǎng)（Second heart field，SHF）祖細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的［4-5］。哺乳動(dòng)物心臟主要是由第一心場(chǎng)（First heart field，F(xiàn)HF）和 SHF 組成的［6］。在心臟發(fā)育過(guò)程中，位于咽中胚層（Pharyngeal mesoderm，PM）和內(nèi)臟中胚層（Splanchnic Mesoderm，SpM）的 SHF細(xì)胞通過(guò)動(dòng)脈極向 OFT 和 RV 遷移部署，通過(guò)靜脈極貢獻(xiàn)于心房心肌細(xì)胞［5，7］。SHF 祖細(xì)胞向 OFT 貢獻(xiàn)不足會(huì)使 OFT 延長(zhǎng)受損，在人和小鼠中導(dǎo)致心室分割、動(dòng)脈排列的缺陷，如雙出口右心室（Double outlet right ventricle，DORV），主動(dòng)脈騎跨，大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位，肺動(dòng)脈閉鎖和永存動(dòng)脈干（Persistent truncus arteriosus，PTA）等［3，8-9］。迄今，許多學(xué)者在進(jìn)行 SHF 祖細(xì)胞遷移部署的研究，并取得了一定的研究成果和進(jìn)展，但是 SHF 祖細(xì)胞遷移部署的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程尚不清楚。因此，研究追蹤 SHF 細(xì)胞遷移部署的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程對(duì)于闡明哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育過(guò)程具有重要意義，將會(huì)為 SHF 發(fā)育缺陷提供新的視角。

現(xiàn)有標(biāo)記追蹤 SHF 遷移部署的方法主要有胚胎顯微注射染料標(biāo)記［3，10-11］和孕鼠注射染料標(biāo)記［12-13］，前者對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作及實(shí)驗(yàn)條件要求相對(duì)較高。5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EDU）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠插入正在復(fù)制的 DNA 分子中，基于 EDU 與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行高效快速的細(xì)胞增殖檢測(cè)分析。SHF 祖細(xì)胞在 SpM 處具有很強(qiáng)的增殖能力并不斷的向遠(yuǎn)端 OFT 遷移，而遠(yuǎn)端 OFT的 SHF 細(xì)胞并不具有增殖的能力［14］。根據(jù) SHF 祖細(xì)胞增殖和遷移的特性，在特定的時(shí)期通過(guò)向孕鼠脈沖注射 EDU 就能夠?qū)⑴咛?SpM 中處于增殖期的SHF 細(xì)胞進(jìn)行有效的標(biāo)記，而經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的遷移，在 SpM 處被 EDU 脈沖標(biāo)記的 SHF 細(xì)胞將遷移到達(dá)遠(yuǎn)端 OFT，因此，根據(jù) EDU 標(biāo)記細(xì)胞在 OFT 處的距離就可以追蹤 SHF 的遷移情況。Li［13］研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道，在胚胎發(fā)育的 9.25 d（E 9.25）采用 250 mg（相當(dāng)于 10 mg/kg 劑量）EDU 的劑量腹腔注射孕鼠，在注射 EDU 2 h 后，采用腹腔注射 EDU 的類似物胸苷嘧啶核苷（Thymidine）終止 EDU 的作用，于 15 h后檢測(cè)被 EDU 標(biāo)記的 SHF 細(xì)胞的遷移情況。本研究采用該報(bào)道的劑量進(jìn)行 EDU 標(biāo)記和追蹤發(fā)現(xiàn)，大部分胚胎不能被 EDU 有效的標(biāo)記。

在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化劑量和標(biāo)記時(shí)間來(lái)改良 EDU 脈沖標(biāo)記追蹤 SHF 細(xì)胞遷移部署的實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果顯示，采用 40 mg/kg 劑量和 2 h 的標(biāo)記時(shí)間，在所有檢測(cè)的胚胎中，SHF 細(xì)胞都被有效標(biāo)記，且與 10 mg/kg 劑量相比，在 SpM 處 EDU標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。在此條件下，通過(guò) 19 h的追蹤，EDU 標(biāo)記的 SHF 細(xì)胞遷移進(jìn)入遠(yuǎn)端 OFT。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與 10 mg/kg 的劑量相比，采用 40 mg/kg 劑量顯著地增加遠(yuǎn)端 OFT 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率；而在兩種劑量下，EDU 陽(yáng)性細(xì)胞遷移進(jìn)入遠(yuǎn)端 OFT 的距離并沒(méi)有差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在 40 mg/kg 劑量條件下，2 h 和 4 h 的標(biāo)記時(shí)間對(duì) EDU 標(biāo)記效率以及 EDU 標(biāo)記細(xì)胞向 OFT 的遷移距離并沒(méi)有差異?？傊ㄟ^(guò)優(yōu)化 EDU 的劑量和標(biāo)記時(shí)間，本研究擬提供一種有效、方便的追蹤 SHF 遷移部署的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J 小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，EDU 及染色試劑盒購(gòu)于 Invitrogen 公司（C10338），DAPI 購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司（6584）。

1.2 方法

1.2.1 EDU 和胸苷嘧啶核苷腹腔注射 實(shí)驗(yàn)前1 d將成年雄鼠和雌鼠合籠，第2天上午檢栓，將該天見(jiàn)栓受孕的孕鼠標(biāo)記為 E 0.5（胚胎發(fā)育第 0.5 d）。按照文獻(xiàn)報(bào)道，在 E 9.25 時(shí)，腹腔注射給予孕鼠一定劑量的 EDU，在注射 EDU 2 h 后，給予孕鼠 10倍劑量的 EDU 類似物胸苷嘧啶核苷終止 EDU 作用。追蹤 19 h 后處死孕鼠，收獲胚胎（約為 E 10.0）。將收獲的胚胎進(jìn)行連續(xù)石蠟切片和后續(xù)的 EDU 檢測(cè)。EDU 粉末用滅菌的 PBS 配成濃度為 2.5 mg/mL（10 mmol/L）的原液，原液用 PBS 稀釋為 1 mg/mL 的工作濃度使用；胸苷嘧啶核苷用滅菌的雙蒸水配成48.5 mg/mL 原液，原液用雙蒸水稀釋使用。所有操作均在遵守并符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及動(dòng)物管理等相關(guān)條例的條件下進(jìn)行，本研究得到了南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 胚胎的固定、脫水、包埋、切片 （1）頸椎脫臼處死孕鼠，于預(yù)冷 PBS 中小心分離胚胎；（2）4%多聚甲醛固定胚胎 2 h；（3）PBS 清洗 2 次，每次 5 min；（4）梯度乙醇脫水：30% 乙醇，15 min→50%乙醇，15 min→70% 乙醇，15 min→85% 乙醇，15 min→95% 乙醇，15 min；（5）正丁醇透明 3 次，每次 10 min；（6）65℃ 透蠟 1 h，中間換蠟 2-3 次；（7）將胚胎組織進(jìn)行石蠟包埋；（8）石蠟包埋胚胎進(jìn)行連續(xù)切片，厚度 5 μm；（9）胚胎石蠟切片進(jìn)行 EDU染色。

1.2.3 EDU檢測(cè) （1）石蠟組織切片復(fù)水：二甲苯3 次，每次 10 min→梯度乙醇復(fù)水（100% 乙醇，2 min→95% 乙醇，2 min→85% 乙醇，2 min→70%乙醇，2 min→50% 乙醇，2 min→ H2O，2 min）；（2）2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min ；（3）0.5% TritonX-100（PBST） 通 透 20 min；（4）PBS 清 洗 5 min；（5）EDU 染色混合液室溫避光孵育 1 h，染色混合液成分 如 下 ：1×Click-iT EdU reaction buffer：430 μL，10×Click-iT EdU buffer additive ：50 μL，CuSO4（10 mmol/L）：20 μL，Alexa Fluor 555 azide ：1.2 μL ；（6）0.5% Tritonx-100 in 1×PBS 清洗 2-3 次，每次 10 min；（7）甲醇清洗 1-2 次，每次 5 min；（8）PBS清洗 5 min；（9）DAPI 工作液室溫避光孵育 30 min；（10）封片，leica 激光共聚焦顯微鏡下熒光成像。

1.2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 使用 ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)分析EDU 遷移的距離以及 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，將胚胎中包含 OFT 及 SpM 的部位進(jìn)行石蠟切片，對(duì)每只胚胎 OFT 及 SpM 連續(xù)切片的染色結(jié)果進(jìn)行測(cè)量。使用 Graphpad 6.0 對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*代表P＜ 0.05，**代表P＜ 0.01，***代表P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 10 mg/kg劑量EDU顯示較差的標(biāo)記效果

首先給予孕鼠 10 mg/kg 的 EDU（文獻(xiàn)報(bào)道的劑量），2 h 后注射 100 mg/kg的胸苷嘧啶核苷終止EDU 作用；19 h 后處死孕鼠，收獲 E 10.0 胚胎并進(jìn)行連續(xù)石蠟切片和后續(xù)的 EDU 檢測(cè)。同時(shí)為了更好的分析 EDU 標(biāo)記結(jié)果，選取孕鼠的小腸組織檢測(cè)EDU 的標(biāo)記情況（存在大量增殖的細(xì)胞）。

結(jié)果（圖 1）發(fā)現(xiàn)，所有孕鼠的小腸組織都能被 EDU 有效的標(biāo)記；在我們由 4 只孕鼠獲得的 22枚胚胎中，只有 10 枚（50%）胚胎被 EDU 有效標(biāo)記，在另外超過(guò) 50% 的胚胎中，大部分胚胎沒(méi)有 EDU標(biāo)記的細(xì)胞，一部分胚胎有極少量的細(xì)胞被 EDU標(biāo)記；且由同一孕鼠獲取的胚胎中，有些胚胎能被EDU 標(biāo)記，有些卻未被標(biāo)記。以上結(jié)果顯示，采用文獻(xiàn)報(bào)道 10 mg/kg 劑量的 EDU，可以對(duì)孕鼠組織進(jìn)行有效的標(biāo)記，但對(duì)胚胎的標(biāo)記效果較差。

圖 1 10 mg/kg 劑量 EDU 在胚胎中的標(biāo)記效果

2.2 采用40 mg/kg劑量的EDU可對(duì)胚胎進(jìn)行有效的標(biāo)記

10 mg/kg 劑量的 EDU 可對(duì)孕鼠組織進(jìn)行有效標(biāo)記，而胚胎則不能進(jìn)行有效標(biāo)記。我們推測(cè)可能因?yàn)榕咛ゴ嬖谔ケP屏障，相對(duì)于孕鼠自身的組織，劑量過(guò)小的 EDU 較難滲透到胚胎組織中。因此，我們將 EDU 劑量增加至 40 mg/kg，并采用 400 mg/kg 劑量的胸苷嘧啶核苷終止 EDU 標(biāo)記。

為了檢測(cè)該劑量的 EDU 和胸苷嘧啶核苷是否對(duì)孕鼠及胚胎產(chǎn)生毒性，將注射 EDU 和胸苷嘧啶核苷的孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些孕鼠是可以正常產(chǎn)仔，且產(chǎn)下的小崽與正常小崽并沒(méi)有區(qū)別。在分離胚胎過(guò)程中分析觀察孕鼠的形態(tài)、內(nèi)臟器官，以及胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果（圖 2）顯示，該劑量的 EDU 和胸苷嘧啶核苷沒(méi)有影響孕鼠和胚胎的正常機(jī)能和發(fā)育，不會(huì)對(duì)孕鼠和胚胎造成毒性；且由 6 只孕鼠獲取的 31 只胚胎均被 EDU 有效標(biāo)記，在胚胎中出現(xiàn)大量 EDU 陽(yáng)性的 SHF 細(xì)胞，且 EDU 標(biāo)記的 SHF 細(xì)胞已經(jīng)遷移進(jìn)入遠(yuǎn)端 OFT。

檢測(cè) EDU 在 SpM 處對(duì) SHF 祖細(xì)胞的標(biāo)記區(qū)域及標(biāo)記百分率（在 SpM 處，EDU 陽(yáng)性細(xì)胞占 SpM處所有細(xì)胞的百分率）。結(jié)果（圖 3）顯示，EDU 標(biāo)記的 SHF 細(xì)胞只存在于 SpM，沒(méi)有出現(xiàn)在 OFT 區(qū)域；胚胎連續(xù)切片 EDU 檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，SpM處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞約占整個(gè) SpM 細(xì)胞的 53%。以上結(jié)果說(shuō)明，采用 40 mg/kg 的劑量屬于安全劑量，且對(duì)胚胎的 SHF 細(xì)胞能夠進(jìn)行有效的標(biāo)記。

圖 2 E 10.0，胚胎中EDU的標(biāo)記情況

A-A’：E 9.25，胚胎中 EDU 標(biāo)記 SHF 細(xì)胞的分布 ；B ：E 9.25，SpM 處 EDU陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。白色虛線標(biāo)識(shí)的是 SpM 部位，紅色虛線標(biāo)識(shí)的是 OFT部位。標(biāo)尺= 50 μm

2.3 評(píng)估劑量對(duì)追蹤SHF細(xì)胞遷移的效果

為評(píng)估劑量對(duì)追蹤 SHF 細(xì)胞遷移的效果，我們將 40 mg/kg 和 10 mg/kg 兩種劑量的效果進(jìn)行對(duì)比分析。由于采用 10 mg/kg 劑量對(duì)胚胎的標(biāo)記效率較低，通過(guò)增加孕鼠數(shù)量來(lái)增加被有效標(biāo)記的胚胎數(shù)量。

統(tǒng)計(jì)分析 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞遷移進(jìn)入 OFT 處的距離，以及 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞在遠(yuǎn)端 OFT 遷移距離中EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率（以下簡(jiǎn)稱 OFT 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞百分率）。結(jié)果（圖 4）顯示，兩種劑量對(duì)EDU 陽(yáng)性 SHF 細(xì)胞在遠(yuǎn)端 OFT 的遷移距離沒(méi)有差別；相比 10 mg/kg 劑量（OFT 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞百分率為 31%），40 mg/kg 劑量標(biāo)記的胚胎中，OFT 處EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率有了顯著性提高（54%），且OFT 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率與 E 9.25 時(shí) SpM 處EDU 陽(yáng)性細(xì)胞百分率一致。

以上結(jié)果表明，采用 40 mg/kg 劑量的 EDU 脈沖標(biāo)記能夠真實(shí)、有效地追蹤 SHF 細(xì)胞向 OFT 遷移。

圖 4 劑量對(duì)追蹤 SHF 細(xì)胞遷移的影響

2.4 評(píng)估EDU脈沖標(biāo)記時(shí)間的影響

為了檢測(cè) EDU 標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記效率及細(xì)胞遷移的影響，在 40 mg/kg EDU 劑量條件下，分析比較 2 h 和 4 h 的標(biāo)記效率。由于 E 10.0 時(shí) OFT 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率與 E 9.25 時(shí) SpM 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞百分率一致，這里用 E 10.0 處 EDU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分率分析 EDU 的標(biāo)記效率。

注射 EDU，分別在 2 h 和 4 h 給予 400 mg/kg 胸苷嘧啶核苷終止標(biāo)記，19 h 后收獲 E 10.0 胚胎，分析統(tǒng)計(jì) OFT 處 EDU 陽(yáng)性 SHF 細(xì)胞的百分率和遷移距離。結(jié)果（圖 5）顯示，4 h EDU 標(biāo)記時(shí)間與 2 h EDU 標(biāo)記時(shí)間，在 OFT 處 EDU 陽(yáng)性 SHF 細(xì)胞的百分率和遷移距離中沒(méi)有表現(xiàn)出差異。說(shuō)明 2 h 標(biāo)記時(shí)間即可將 SpM 處增殖的 SHF 進(jìn)行充分有效的標(biāo)記。考慮到 4 h 的標(biāo)記可能會(huì)對(duì)細(xì)胞遷移產(chǎn)生一定的影響，采用 2 h 的 EDU 標(biāo)記時(shí)間具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖 5 EDU 標(biāo)記時(shí)間的影響

3 討論

先天性心臟缺陷中約有 30% 是由于 OFT 發(fā)育缺陷引起的。OFT 和 RV 是由第二心場(chǎng)祖細(xì)胞貢獻(xiàn)發(fā)育而來(lái)的，SHF 祖細(xì)胞發(fā)育缺陷將引起動(dòng)脈及對(duì)應(yīng)心室排列、動(dòng)脈分隔的缺陷，在人和小鼠中導(dǎo)致DORV、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、PTA 等心臟發(fā)育的異常。迄今為止，SHF 祖細(xì)胞向 OFT 遷移、部署的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程仍是尚未闡明清楚的問(wèn)題，也是目前很多科學(xué)工作者正在研究攻克的方向。目前，研究 SHF 遷移、部署過(guò)程所采用的實(shí)驗(yàn)方法有胚胎顯微注射染料并結(jié)合胚胎體外培養(yǎng)［3，10］、胚胎厚切片培養(yǎng)結(jié)合雙光子顯微成像系統(tǒng)［15］、孕鼠腹腔注射 EDU 脈沖標(biāo)記結(jié)合石蠟切片免疫熒光染色技術(shù)［12-13］等。前兩種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、操作環(huán)境、儀器設(shè)備及實(shí)驗(yàn)人員的操作等均有很高的要求和難度，需要配套有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備，給實(shí)驗(yàn)的實(shí)施帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。而 EDU 脈沖標(biāo)記是通過(guò)將 EDU 腹腔注射孕鼠，EDU 摻入處于細(xì)胞增殖 S 期正在復(fù)制的 DNA分子中，基于 EDU 與染料的共軛反應(yīng)可以對(duì) EDU進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)操作人員的技術(shù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和條件要求不高。因此，EDU 脈沖標(biāo)記追蹤 SHF 細(xì)胞的遷移部署過(guò)程具有很強(qiáng)的實(shí)施性和操作性。

本研究在使用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行 EDU 脈沖標(biāo)記追蹤 SHF 細(xì)胞的遷移過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，EDU 不能將胚胎中處于增殖期的細(xì)胞進(jìn)行有效的標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)調(diào)整 EDU 的劑量及標(biāo)記時(shí)間，我們探索并優(yōu)化出標(biāo)記追蹤 SHF 細(xì)胞遷移的有效方法：給予孕鼠腹腔注射 40 mg/kg 劑量的 EDU，標(biāo)記 2 h 后，腹腔注射給予 400 mg/kg 的胸苷嘧啶核苷終止 EDU標(biāo)記，繼續(xù)追蹤 19 h 可在遠(yuǎn)端 OFT 處觀察到大量EDU 陽(yáng)性的細(xì)胞。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了EDU脈沖標(biāo)記追蹤 SHF 細(xì)胞遷移部署的方法，在對(duì)孕鼠和胚胎不產(chǎn)生毒性的前提下，顯著提高 EDU 在胚胎中的標(biāo)記效果以及在 SHF細(xì)胞的標(biāo)記效率，提供了一種有效、方便的追蹤SHF 遷移部署的方法。