段玉紅 高 泓 蘇虹霞

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二科，咸陽，712000; 2 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科研科，成都，610075)

糖尿病嚴(yán)重威脅人類健康，發(fā)病率逐年上升，成為威脅人類健康的慢性疾病之一。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，而且也受自身體質(zhì)、生活環(huán)境、飲食等因素的影響，使其病機(jī)十分復(fù)雜[1-2]。在糖尿病的分類中，大約95%為2型糖尿病(T2DM)，其為代謝異常綜合征。主要由環(huán)境因素和遺傳因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。面對T2DM及其并發(fā)癥給患者帶來的危害，預(yù)防和治療T2DM成為研究的熱點[3]。目前，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，人們對中藥的認(rèn)識和信任，使糖尿病的治療有了新的突破。大黃、黃連、知母等多種中藥及復(fù)方都具有降糖作用，而且不良反應(yīng)少。其降糖機(jī)制具有多成分-多靶點-多通路等特點，影響糖代謝、胰島素分泌、改善臨床癥狀、修復(fù)胰島B細(xì)胞等達(dá)到降糖效果[4-6]。依據(jù)T2DM的發(fā)病機(jī)制，確立了清熱解毒、泄毒、瀉火的治療方法，基于文獻(xiàn)及經(jīng)典方劑選取三黃湯進(jìn)行研究。

三黃湯由黃連、黃芩、大黃組成，出自《傷寒論》瀉心湯方。方中黃連、黃芩、大黃為典型寒性中藥，黃連、黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，兩者相須為用，增強(qiáng)清熱燥濕之功，共為君藥。大黃具有清熱瀉火、瀉下攻積、涼血解毒等功效。黃連、黃芩、大黃共用可清三焦之熱，相輔相成。因此本研究選擇三黃湯辨治組方思路與降糖、降脂的研究思路相一致。已經(jīng)有相關(guān)報道三黃湯對T2DM有較好的治療作用[7]，但其發(fā)揮作用的主要化學(xué)成分及靶點并不明確，所以本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺篩選三黃湯發(fā)揮作用的有效化學(xué)成分，采用CTD篩選T2DM的靶標(biāo)基因。通過DAVID 6.8對靶標(biāo)基因進(jìn)行分子功能分析，同時通過STRING進(jìn)行基因相互作用分析，篩選T2DM的關(guān)鍵靶標(biāo)基因，基于分子對接技術(shù)對關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行驗證。并采用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建三黃湯成分-關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)模型。明確三黃湯中14種化學(xué)成分通過相互協(xié)同治療T2DM。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 三黃湯化學(xué)成分 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)在Herb name中進(jìn)行查找黃連、黃芩、大黃的化學(xué)成分[8-9]?；贑TD(http://ctdbase.org/)篩選T2DM的靶標(biāo)基因。參照Lipinski′s五規(guī)則，選擇同時滿足-2≤ALogP≤5，OB≥50%，DL≥0.18，MW≤500篩選三黃湯有效化學(xué)成分。

1.1.2 靶點分子功能 基于DAVID6.8生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫可以對靶標(biāo)蛋白或基因進(jìn)行分子功能、生物過程、細(xì)胞成分等分析。

1.1.3 基因相互作用 STRING(https://string-db.org/)，將2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)中的30個基因輸入到STRING中，對30個基因之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.1.4 分子對接 iGEMDOCK操作相對比較簡單，而且對接范圍比較廣，也可以用于金屬對接。

1.2 方法

1.2.1 三黃湯化學(xué)成分篩選 相關(guān)參數(shù)設(shè)置為口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥50%,類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18，-2≤脂水分配系數(shù)(ALogP)≤5分子量(Molecular Weight,MW)≤500。在TCMSP中下載小分子MOL2結(jié)構(gòu)，采用Open Babel-2.4.1構(gòu)建成三維結(jié)構(gòu)，對其加氫、加電荷。Open Babel為開源軟件，一般用來進(jìn)行多種分子結(jié)構(gòu)文件格式的相互轉(zhuǎn)換，也可以計算結(jié)構(gòu)描述參數(shù)。

1.2.2 T2DM的靶點篩選 在Diseases(疾病)中輸入2型糖尿病(Diabetes Mellitus,Type 2)或D003924。進(jìn)行檢索，選擇參考數(shù)(Reference Count)大于等于130作為T2DM靶標(biāo)基因。靶標(biāo)基因包括：基因名稱(Gene Symbol),基因ID(Gene ID),疾病名稱(Disease Name),疾病ID(Disease ID),參考數(shù)(Reference Count)相關(guān)信息。

1.2.3 潛在靶點分子功能分析及構(gòu)建分子功能-靶點網(wǎng)絡(luò)模型 在線打開DAVID Bioinformatics Resources 6.8，將基因ID(Gene ID)輸入到基因列表(Gene List)中，相關(guān)參數(shù)選擇為：基因ID(GENE_ID)，List Type(列表類型)：Gene List(基因列表)。最后選擇提交列表(Submit List)。同時，基于Cytoscape 3.5.1軟件[10]建立分子功能-靶點網(wǎng)絡(luò)模型。網(wǎng)絡(luò)包括活性成分、靶點2類節(jié)點。若某一靶點為某化合物的潛在作用靶點，則以邊(edge)相連。

1.2.4 基因相互作用分析 輸入30個基因名稱(Gene Symbol)，來源(Organism):人源(Homo sapiens)，進(jìn)行相互作用分析。

1.2.5 關(guān)鍵靶點分子對接 小分子支持PDB，MOL和MOL2 3種格式。對接后的結(jié)果以氫鍵(H),電荷能(E)和范德瓦爾力(V)等作用統(tǒng)計，并將能量轉(zhuǎn)換成單位kcal/mol[11-13]。將三黃湯和陽性藥共15化學(xué)成分與關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行對接。相關(guān)參數(shù)設(shè)置：解的個數(shù)(Number of solution)：2，子代(Generation)：70，群體大小(generic evolutionary method)：200。

2 結(jié)果

2.1 三黃湯有效化學(xué)成分 黃連活性成分5個，大黃活性成分2個，黃芩活性成分7個。見表1。

表1 三黃湯化學(xué)成分

2.2 靶標(biāo)基因 基于CTD數(shù)據(jù)庫查找T2DM的潛在靶點30個。見表2。

表2 T2DM的靶標(biāo)信息

2.3 潛在靶標(biāo)分子功能 30個基因進(jìn)行分子功能富集分析，選擇靶標(biāo)基因顯著發(fā)揮作用的分子功能(P<0.05)，涉及的主要分子功能:亞鐵血紅素結(jié)合(Heme Binding)，酶結(jié)合(Enzyme Binding)，蛋白酶結(jié)合(Protease Binding)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Transcription Factor Binding)，蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein Binding)等。即三黃湯治療T2DM可能主要通過8項分子功能的相關(guān)靶標(biāo)分子發(fā)揮治療作用。采用Cytoscape 3.5.1軟件建立分子功能-靶點網(wǎng)絡(luò)模型，發(fā)現(xiàn)NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7個基因涉及到4項及4項以上的分子功能。發(fā)揮重要作用，為主要靶標(biāo)基因，將進(jìn)一步進(jìn)行分子對接分析。見圖1。

2.4 潛在靶標(biāo)相互作用 30個基因之間的相互作用關(guān)系采用STRING軟件進(jìn)行分析，獲取衡量網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)。每一個節(jié)點代表一個基因，基因名稱位于節(jié)點右上方，邊(edge)表示基因和基因之間的功能性關(guān)聯(lián)，其顏色不同代表不同的作用關(guān)系。相關(guān)參數(shù)為：節(jié)點數(shù)(Number of Nodes):29，邊數(shù)(Number of Edges):304，平均節(jié)點度(Average Node Degree):21，avg.局部聚類系數(shù)(Avg.local Clustering Coefficient):0.873，預(yù)期邊緣數(shù)(Expected Number of Edges):79,PPI富集p值(PPI Enrichment p-value):<1.0e-16。相互作用結(jié)果和分子功能分析結(jié)果相一致，NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1 7個基因的degree≥15。整個網(wǎng)絡(luò)以NFKB1A，BCL2，TNF，RELA，TGFB1，PPARG，HMOX1等靶標(biāo)基因為中心進(jìn)行相關(guān)聯(lián)，去掉關(guān)鍵基因，整個網(wǎng)絡(luò)渙散。見圖2。

圖1 分子功能-靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)

注：紅色節(jié)點表示分子功能，藍(lán)色節(jié)點表示靶標(biāo)，黃色節(jié)點表示degree≥4的關(guān)鍵靶標(biāo)

圖2 基因相互作用

注：紅線：融合的證據(jù)；綠線：共同相鄰蛋白；藍(lán)線：證據(jù)存在；紫色：實驗室數(shù)據(jù)；黃線：文獻(xiàn)檢索；淡藍(lán)色：相關(guān)性聯(lián)系；黑色：共表達(dá)

圖3 三黃湯多成分-關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)模型

注：紅色-關(guān)鍵靶標(biāo)，藍(lán)色-化學(xué)成分

2.5 靶標(biāo)驗證 選擇T2DM關(guān)鍵靶標(biāo)(BCL2,PPARG，HMOX1)基因與三黃湯14個有效化學(xué)成分進(jìn)行分子對接。靶標(biāo)基因的三維結(jié)構(gòu)下載于PDB數(shù)據(jù)庫。分別為BCL2(4MAN)，PPARG(3U9Q)，HMOX1(1N45)。表3列出三黃湯化學(xué)成分與關(guān)鍵靶標(biāo)對接后的數(shù)值。評價標(biāo)準(zhǔn)以結(jié)合能(affinity)為主，結(jié)合能越小越穩(wěn)定。為了使結(jié)果更清晰，構(gòu)建了化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，其中13個化學(xué)成分與PPAR結(jié)合，(R)-Canadine為結(jié)合能量最低；4個化學(xué)成分與BCL2結(jié)合，NEOBAICALEIN為結(jié)合能量最低；14個化學(xué)成分與HMOX1結(jié)合，NEOBAICALEIN為結(jié)合能量最低。

3 討論

T2DM的發(fā)病率逐年上升，與肥胖、血脂異常、代謝異常等諸多疾病關(guān)系密切。影響人們的身心健康，所以預(yù)防和治療T2DM當(dāng)今難題[14]。目前，主要采用調(diào)節(jié)胰島素、控制血糖等進(jìn)行治療，但是往往會出現(xiàn)一些不良反應(yīng)及并發(fā)癥[15]。三黃湯(黃連、大黃、黃芩)為臨床清熱燥濕常用方劑，藥理作用廣泛，人們對三黃湯藥理作用機(jī)制研究逐漸深入。而三黃湯對糖尿病的治療臨床上有較好的效果，但是機(jī)制不明確，本研究初步篩選T2DM的關(guān)鍵靶標(biāo)，對其關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行深入研究。對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)三黃湯中的14個有效化學(xué)成分，13個化學(xué)成分與PPAR結(jié)合，4個化學(xué)成分與BCL2結(jié)合，14個化學(xué)成分與HMOX1結(jié)合。因此，三黃湯中14種化學(xué)成分通過相互協(xié)同治療T2DM。Bcl2(BCL2,Apoptosis Regulator)是主要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。已經(jīng)有研究表明,與空白對照組比較，模型組(2型糖尿病)大鼠胰腺Bcl2基因表達(dá)降低[16]。葡萄糖與胰島B細(xì)胞相互影響，長時間處于高葡萄糖狀態(tài)，導(dǎo)致B細(xì)胞的凋亡，其凋亡與BCL基因家族中的平衡相關(guān)；血紅素加氧酶1(HMOX1)為降解血紅素的限速酶[17-18]。主要在細(xì)胞增殖、氧化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，已經(jīng)有報道HMOX1對脂肪細(xì)胞的分化有調(diào)節(jié)作用。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)主要調(diào)節(jié)脂肪的生成[19]。HMOX1和PPAR-γ相互影響，PPAR-γ的異位表達(dá)影響脂肪細(xì)胞分化，HMOX1表達(dá)不斷降低。BCL2,PPARG，HMOX1在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。

表3 三黃湯與關(guān)鍵靶標(biāo)對接結(jié)果(kcal/mol)