李 瑞 劉 康 李 浩 張 巖 陳 智 袁彗星 李明超 王 濤 藍(lán)儒竹 劉繼紅 饒 可

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（武漢 430030）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）影響著全世界5%～20%的成年男性，其致病因素較多，包括精神因素、心血管疾病、盆腔手術(shù)以及代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）等[1]。隨著飲食習(xí)慣和生活方式的改變，MetS病人越來越多，由MetS導(dǎo)致的ED（metabolic syndrome related erectile dysfunction，MED）也受到越來越多的關(guān)注。MetS不是一種特定的疾病，而是指體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂而造成的一系列綜合征，以胰島素抵抗為中心，常表現(xiàn)為腹型肥胖、高血壓、高血脂、高血糖中的至少3種[2]。MetS在不同種族人群中的發(fā)病率為20%～40%，且隨著年齡的增加而升高[3]。MetS是一種復(fù)雜的全身代謝性疾病，其組成要素腹型肥胖、高血壓、高血脂、高血糖均是ED的危險因素，這幾種危險因素累加，引起ED的風(fēng)險更大[4]。研究發(fā)現(xiàn)，MetS病人患ED的概率是普通人的兩倍，且ED的癥狀更嚴(yán)重，并對5型磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase type 5 inhibitors，PDE5i）反應(yīng)不佳[5,6]。因此，研究MED的致病機(jī)制可能會為這些病人的治療探索新的靶點，并為臨床診治提供新的策略。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指氧自由基和氧化作用較強(qiáng)的非自由基含氧產(chǎn)物，是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)品。ROS主要是由氧產(chǎn)生，包括超氧陰離子、氫氧根離子、過氧化氫、一氧化氮、羥自由基等[7]。機(jī)體有多種酶參與活性氧的生成，包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶、黃嘌呤氧化酶、細(xì)胞色素P450、一氧化氮合成酶等，其中NADPH氧化酶是體內(nèi)活性氧生成的重要來源。NADPH氧化酶是一種輔酶，也叫還原型輔酶Ⅱ，由p22phox、p40phox、p47phox、p67phox、gp91phox和GTP酶Rac構(gòu)成的復(fù)合體。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在去勢大鼠陰莖海綿體組織中，活性氧水平增高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增加，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，cGMP產(chǎn)生減少，導(dǎo)致ED發(fā)生[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病、高脂血癥、老齡和高尿酸血癥性ED病理過程中，體內(nèi)ROS產(chǎn)生增多，氧化應(yīng)激水平增高，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，NO生成和釋放減少，cGMP含量降低，最終導(dǎo)致ED[9-13]。但在MED大鼠模型中，相關(guān)研究較少。

本研究通過喂養(yǎng)法建立MED大鼠模型，研究MED大鼠陰莖海綿體組織中氧化應(yīng)激水平的變化，探討氧化應(yīng)激導(dǎo)致MED的機(jī)制。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

3周齡健康雄性SD大鼠40 只，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

（二）藥物及試劑

高脂高糖飼料（D12492，北京華阜康生物科技股份有限公司），胰島素測定試劑盒、膽固醇測定試劑盒、甘油三脂測定試劑盒、高密度脂蛋白測定試劑盒、低密度脂蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RIPA 裂解液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），蛋白酶抑制劑Cocktail（美國羅氏公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），gp91phox抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），eNOS抗體（美國Abcam公司），DHE試劑盒（威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司），cGMP試劑盒（南京建成生物工程研究所），ECL試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

（三）主要儀器

Powerlab四通道生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments公司）。

二、方法

（一）MED模型建立

將40只3周齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組，正常對照組10只，喂普通飼料；實驗組30只，喂高脂高糖飼料（D12492），喂養(yǎng)時間為6個月。

（二）MED模型建立及海綿體測壓

喂養(yǎng)6個月后檢測大鼠的體質(zhì)量、無創(chuàng)血壓計檢測大鼠血壓、血糖儀檢測空腹血糖、尾靜脈取血檢測大鼠血漿胰島素濃度和血脂等代謝參數(shù)。篩選出MetS大鼠后進(jìn)行阿撲嗎啡（apomorphine，APO）試驗，APO按100μg/kg皮下注射，給藥后于陰暗環(huán)境中觀察，以大鼠陰莖體增長、露出作為勃起功能良好的標(biāo)志，即APO（+）；反之則為APO（-）。APO（-）大鼠即為篩選出的MED大鼠。大鼠測體質(zhì)量后腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉（40mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉完全后依次剪開大鼠頸部正中皮膚、筋膜、肌肉，暴露一側(cè)頸總動脈。仔細(xì)游離與頸總動脈緊密相連的迷走神經(jīng)，并用絲線結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)心端，近心端使用動脈夾夾閉。將充滿肝素生理鹽水的PE-50管與Powerlab/4SP數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)連接。在顯微鏡下用顯微剪剪開頸總動脈，將PE-50管插入頸總動脈，絲線結(jié)扎固定PE-50管。移除近心端動脈夾，Powerlab/4SP數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)收集大鼠血壓信息。沿腹部正中線剪開腹部皮膚、腹壁肌肉，分離盆腔內(nèi)前列腺與周圍組織。找到位于前列腺后外側(cè)的膨大的盆神經(jīng)節(jié)，其中由盆神經(jīng)節(jié)發(fā)出的較大的分支且向陰莖方向斜行走行的即為海綿體神經(jīng)。鑷子牽拉陰莖，剪開陰莖皮膚及皮下筋膜，充分暴露陰莖海綿體。將25 G靜脈輸液針與Powerlab/4SP 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)連接，使用肝素生理鹽水沖洗導(dǎo)管。將輸液針針頭插入一側(cè)陰莖海綿體內(nèi)，調(diào)整陰莖海綿體內(nèi)的針頭，使其與海綿竇連接通暢。打開Powerlab/4SP 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)的電刺激選項，將刺激參數(shù)調(diào)為15 Hz、1.2 ms，采用5.0 V電壓刺激海綿體神經(jīng)，持續(xù)時間為1min，刺激間隔為10min。測壓完畢后，注射過量空氣處死大鼠。收集陰莖海綿體組織，PBS沖洗后平均分為三段，將中段海綿體制備冰凍切片，其余兩段放至-80℃冰箱保存。

（三）Western blot 檢測陰莖海綿體組織中g(shù)p91phox和eNOS蛋白表達(dá)

將大鼠陰莖海綿體100mg剪碎后加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，用超聲破碎蛋白。然后4℃離心機(jī)中12 000×g離心10min，取上清，用BCA法測定蛋白濃度后取總蛋白量40μg，100℃煮沸10min。配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，然后使用5%的BSA 封閉 PVDF膜2h，封閉后放入gp91phox（1：200）, eNOS（1：1000）抗體中孵育過夜。取出后洗膜3次，每次 10min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠二抗（1：5000）繼續(xù)孵育1h。孵育完成后再次洗膜30 min，采用 ECL 化學(xué)發(fā)光并采集圖像進(jìn)行處理，用 Quantity One 軟件分析圖像。

（四）陰莖海綿體組織活性氧水平檢測

將大鼠陰莖海綿體組織制備成8mm厚的冰凍切片，并將冰凍切片放至室溫平衡。配制濃度為1μmol/L的二氫乙啶溶液，冰凍切片避光添加二氫乙啶溶液，37℃溫箱中避光孵育30min，孵育結(jié)束后用PBS清洗玻片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，隨后采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行定量分析。

（五）陰莖海綿體組織cGMP濃度檢測

陰莖海綿體組織放入勻漿器，置于冰上，加400μL RIPA裂解液（含PMSF和Cooktail）于勻漿器中快速勻漿10min，磨碎組織，冰上裂解30min后，用移液器將裂解混合物轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4℃下12 000×g離心10min。提取的蛋白裂解液按照說明書檢測陰莖海綿體組織cGMP濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組大鼠代謝參數(shù)比較

MED組大鼠接受高脂高糖飼料喂養(yǎng)6個月后，體質(zhì)量、空腹血糖、血膽固醇、血胰島素明顯高于正常對照組（表1）。

表1 兩組大鼠代謝參數(shù)

二、兩組大鼠Max ICP/MAP比較

用5.0V電壓刺激對照組大鼠陰莖海綿體神經(jīng)后，Max陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）/平均動脈壓（MAP）為0.75±0.04，用5.0V電壓刺激MED組大鼠陰莖海綿體神經(jīng)后，Max ICP/MAP為0.46±0.05。MED組大鼠Max ICP/MAP明顯低于正常對照組，P＜0.05（圖1）。

圖1 兩組大鼠勃起功能檢測

三、兩組大鼠陰莖海綿體組織中活性氧水平比較

MED組大鼠陰莖海綿體組織中活性氧水平明顯高于正常對照組，氧化應(yīng)激水平明顯增加（圖2A，圖2B）。

四、兩組大鼠陰莖海綿體組織gp91phox蛋白表達(dá)比較

五、兩組大鼠陰莖海綿體組織eNOS蛋白表達(dá)和cGMP濃度比較

MED組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS表達(dá)明顯低于正常對照組，cGMP濃度也明顯低于正常對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖2 兩組大鼠陰莖海綿體組織中氧化應(yīng)激水平

圖3 兩組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS蛋白表達(dá)水平和cGMP濃度

討 論

目前認(rèn)為MetS導(dǎo)致ED主要包括以下幾個機(jī)制[14]：（1）陰莖局部的氧化應(yīng)激；（2）陰莖海綿體內(nèi)皮功能障礙；（3）陰莖血管的損害；（4）性腺功能減退；（5）持續(xù)的高血糖狀態(tài)使泌尿生殖系統(tǒng)感覺神經(jīng)發(fā)生病變，影響傳遞到陰莖的神經(jīng)遞質(zhì)[如神經(jīng)源型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）]釋放減少；（6）胰島素抵抗引起陰莖平滑肌對舒血管物質(zhì)的反應(yīng)性下降和陰莖局部縮血管物質(zhì)的釋放增加；（7）治療MetS的某些藥物（如β-受體阻滯劑等）可能影響陰莖勃起；（8）病變晚期陰莖海綿體組織纖維化。本研究把焦點集中在MetS病理條件下，陰莖組織中氧化應(yīng)激是否發(fā)生變化，發(fā)生怎樣的變化?

生理水平的活性氧對于維持機(jī)體正常的生理功能具有重要意義，然而當(dāng)活性氧過多積聚，超過抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對機(jī)體造成氧化損傷。ROS在體內(nèi)無處不在，他的產(chǎn)生可能是病理的或生理的，取決于各種情況。線粒體電子傳遞系統(tǒng)和NADPH氧化酶是ROS最常見的來源，而細(xì)胞色素P450和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及髓過氧化物酶是一些能產(chǎn)生這些活性自由基的其他來源。其中NADPH氧化酶是內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的主要來源。Glennon-Alty等研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病中NADPH氧化酶被激活，產(chǎn)生大量的超氧自由基和過氧化氫，導(dǎo)致ROS水平增高，從而引起一系列氧化損傷[15]。Manea等研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病病理過程中，組蛋白去乙?；改苌险{(diào)NADPH氧化酶亞基的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步增加活性氧水平，降低NADPH氧化酶亞基的蛋白表達(dá)后，活性氧水平降低[16]。Yin等研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病ED小鼠陰莖組織中，P47phox激活，使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致ROS過量增加[17]。我們研究發(fā)現(xiàn)在MED大鼠陰莖海綿體組織中NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)增高，DHE染色顯示ROS產(chǎn)生增多。這表明ROS產(chǎn)生增多可能是由gp91phox表達(dá)增高，NADPH氧化酶活性增強(qiáng)導(dǎo)致。

近來有研究報道在門靜脈高壓大鼠的腸系膜內(nèi)皮細(xì)胞中NADPH氧化酶被激活后產(chǎn)生過量的ROS，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，給予抗氧化劑治療后能降低ROS水平，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[18]，另有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型中NADPH氧化酶被激活，引起ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致氧化損傷，進(jìn)一步損害內(nèi)皮功能[19]。在正常情況下，機(jī)體通過氧化和抗氧化機(jī)制使體內(nèi)ROS的生成和清除達(dá)到動態(tài)平衡，使ROS保持在正常水平。Huang等研究發(fā)現(xiàn)在吸煙誘導(dǎo)ED的大鼠模型中，大鼠陰莖組織中ROS水平明顯增高，導(dǎo)致陰莖組織的凋亡明顯增強(qiáng)，陰莖平滑肌數(shù)量明顯減少，陰莖內(nèi)皮的完整性也受到破壞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致ED的發(fā)生[20]。同樣在老齡性ED，高脂血癥性ED和高尿酸血癥性ED中都發(fā)現(xiàn)有ROS產(chǎn)生增多，損害內(nèi)皮細(xì)胞功能和NO/cGMP信號通路，最終導(dǎo)致ED[9,12,13]。然而，在MED病理過程中ROS對陰莖海綿體內(nèi)皮功能的作用還不得而知。我們研究發(fā)現(xiàn)在MED大鼠陰莖海綿體中NADPH氧化酶亞基gp91phox表達(dá)增高，DHE染色顯示ROS產(chǎn)生增多，eNOS和cGMP表達(dá)下調(diào)。因此ROS過量產(chǎn)生損害內(nèi)皮功能可能是MED的重要機(jī)制。

綜上所述，MetS可能通過激活陰莖海綿體NADPH氧化酶活性，上調(diào)陰莖海綿體平滑肌組織中活性氧的表達(dá)，引起氧化損傷，損害內(nèi)皮細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致ED的發(fā)生。